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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.57 틸바로신(Tylvalosin)
  • 8.3.57 틸바로신(Tylvalosin)

    1) 시험법 적용범위

    축산물 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    시료중분석대상물질을0.1%포름산함유 아세토니트릴으로 추출하여헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액: 각 표준품을메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

    라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

    마) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

    바) 10 mM 포름산암모늄 용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄(ammonium formate)0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 용액7.5 mL를넣는다. 이를 10분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리하여상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 용액7.5 mL를넣고10분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,600G로15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운50 mL 원심분리관에 상층액ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 넣고 10분간흔들어 섞고4℃에서 2,600G로15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃이하에서0.3 mL가 될 때까지질소농축한다.농축액에 10 mM 포름산암모늄 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액1.7 mL를넣고 흔들어 섞는다.4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1) 컬럼: C18(2.0 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A:10 mM 포름산암모늄 수용액

    (나) 이동상 B: 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    90

    10

    3

    90

    10

    5

    10

    90

    13

    10

    90

    15

    90

    10

    20

    90

    10

    (3) 유속: 0.25 mL/분

    (4)컬럼온도: 35℃

    (5) 주입량: 10 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionizationmode: ESI(positive)

    (2) Capillary temperature: 350℃

    (3) Collision gas: N2(질소)

    연번

    물질명

    (Compound)

    머무름 시간

    (분)

    이온화

    (Ionizationmode)

    관측질량

    (Exact mass)

    선구이온

    (Precursor

    ion,m/z)

    생성이온

    (Product

    ion,m/z)

    충돌에너지

    (Collision energy, eV)

    1

    틸바로신

    (Tylvalosin)

    10.49

    Positive

    1041.6

    1042.5

    109.2

    75

    174.1

    59

    229.1

    47

    2

    3-AT

    (3-O-Acetyltylosin)

    10.07

    Positive

    957.5

    958.6

    772.0

    45

    772.5

    41

    (4) 분석대상물질의 개별조건

    ※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    7) 정성시험

    가) 정성 및 확인

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
    확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

    주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율

    (Base peak에 대한 %)

    허용범위

    > 50%

    ± 20%

    > 20%, ≤ 50%

    ± 25%

    > 10%, ≤ 20%

    ± 30%

    나) 표준품 크로마토그램

    틸바로신

    3-AT

    그림 1. 틸바로신(11.2분), 3-AT(10.07분) 표준품의 크로마토그램(각 0.005 mg/L)

    8) 정량시험

    가) 정량

    조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

    나) 정량한계

    틸바로신(Tylvalosin): 0.002 mg/kg

    3-AT(3-O-Acetyltylosin): 0.0005 mg/kg