8.3.67 디클로페낙(Diclofenac), 메토서페이트(Metoserpate), 부퀴놀레이트(Buquinolate)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중의 분석대상물질을포름산암모늄 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다)표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라)혼합표준용액: 각각의표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 0.1%아세트산(acetic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 0.1%포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

바) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1%포름산 함유 아세토니트릴을10 mL를넣고10분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리한다. 상층액을50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 10 mL를 넣고 10분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,600G로15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 담아40℃ 이하에서0.3 mL가 될 때까지질소농축한후 0.1% 아세트산 용액:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 1.7 mL를넣고 녹인다.4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)컬럼:C18(2.0 mm × 100 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:0.1% 아세트산 수용액

(나) 이동상 B: 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	90	10
3	90	10
5	10	90
13	10	90
15	90	10
20	90	10

(3) 유속: 0.25 mL/분

(4) 컬럼 온도: 30℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive, negative)

(2) Capillary temperature : 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4) 분석대상물질의 개별조건

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	디클로페낙 (Diclofenac)	12.58	Negative	295.0	293.7	250.0	12
						214.0	28
						178.0	38
2	메토서페이트 (Metoserpate)	9.03	Positive	428.2	429.1	174.1	41
						131.1	89
						130.0	119
3	부퀴놀레이트 (Buquinolate)	12.19	Positive	361.2	362.1	204.0	49
						316.2	23
						148.1	65

※밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가)정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

디클로페낙

메토서페이트

부퀴놀레이트

그림 1. 디클로페낙(12.58분), 메토서페이트(9.03분), 부퀴놀레이트(12.19분)표준품의 크로마토그램 (각 0.005 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

디클로페낙(Diclofenac): 0.002 mg/kg

메토서페이트(Metoserpate): 0.001 mg/kg

부퀴놀레이트(Buquinolate): 0.001 mg/kg