8.2.2.2 수산물 중 동물용의약품 동시 다성분 시험법

1) 시험법 적용범위

수산물(어류, 갑각류) 등에 적용한다.

2) 분석원리

균질화한시료에 0.1 M EDTA in 50 mM 아세트산암모늄 완충용액(pH 4.0)으로 산처리후, 80% 아세토니트릴로 추출하고 C18, PSA(Primary Secondary Amine)를 이용하여 정제한후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액:각 표준품을 [표 1]의 용매를 참조하여 조제한 용액을표준원액으로 한다.

라) 혼합표준용액:각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.

마) 0.1 M Na2-EDTA가 함유된 50 mM 아세트산암모늄 완충용액: 1 L 용량플라스크에아세트산암모늄 3.85 g을 넣고 물 0.9 L로 녹인 후 초산으로pH를 4.0으로맞춘다. 여기에 EDTA-나트륨(Na2-EDTA dihydrate) 37.1 g을 넣고녹인 후물로 표시선까지 채운다.

바) 0.1%포름산(formic acid)수용액: 1 L 용량 플라스크에포름산1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사) 2 mM포름산 암모늄 수용액: 1 L 용량 플라스크에포름산암모늄 0.126 g을 넣고 아세토니트릴:물(80:20, v/v) 혼합용액으로 녹여 표시선까지 채운다.

아) 2 mM 포름산 암모늄 및 0.1%포름산함유 아세토니트릴:1 L 용량 플라스크에물 1 mL와포름산암모늄 0.126 g을 잘 녹인 다음포름산1 mL를 넣고아세토니트릴로표시선까지 채운다.

자) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

차) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

표1. 표준원액 조제에 사용되는 용매

용매	대상 동물용의약품
메탄올	날리딕스산, 노르플록사신, 다노플록사신, 독시싸이클린, 디아베리딘,디플록사신, 린코마이신, 마보플록사신,메벤다졸,메벤다졸아민,5-하이드록시 메벤다졸,미노싸이클린,비치오놀,설파구아니딘,설파독신, 설파디메톡신, 설파디아진,설파메라진, 설파메타진,설파메톡사졸, 설파메톡시피리다진, 설파모노메톡신, 설파퀴녹살린,설파클로르피라진, 설파클로르피리다진, 설파티아졸, 설파페나졸,설피속사졸,세파드록실, 세팔렉신*, 세프티오퍼*,데스후로일세프티오퍼*,스피라마이신*, 시프로플록사신, 에리스로마이신,에토파베이트,m-페네티딘, 엔로플록사신, 오르메토프림,오플록사신,옥소린산,옥시테트라싸이클린, 올레안도마이신, 조사마이신, 클로르테트라싸이클린, 클록사실린 클린다마이신, 키타사마이신,테트라싸이클린, 트리메토프림, 트리클로르폰*, 티아물린, 티아벤다졸,5-하이드록시 티아벤다졸,티암페니콜,틸미코신*,페노뷰카브,페플록사신, 푸마길린,프라지콴텔, 플로르페니콜,플로르페니콜 아민, 플루메퀸
50% 메탄올	데하이드로콜산, 벤질페니실린, 아목시실린, 암피실린, 클로람페니콜

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 대사물질임.

※ 대상 동물용의약품은 1,000 mg/kg 농도의 표준원액 혼합물로 제조하여 1개월간 안정함(단, *표시 물질은 쉽게 분해되므로 실험직전에 만들어서 사용)

5) 시험용액의 조제

균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 0.1 M Na2EDTA in 50 mM 아세트산암모늄 완충용액 1 mL를 넣어 산처리 후, 2 mM포름산암모늄 9 mL를넣어5분간흔들어섞은 후4℃에서 10,000G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 PSA 250 mg, C18250 mg이담겨진 50 mL 원심분리관에 취하여 1분간흔들어 섞고, 4℃에서 10,000G로 5분간 원심분리한다. 상층액 중5 mL를취하여 잔류물이 1 mL가 되도록40°C 이하에서질소 농축한다. 농축 후 1 mL를 취하여0.2 μm PVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산수용액

(나) 이동상 B:2 mM포름산암모늄 및 0.1%포름산함유 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	90	10
1.0	90	10
6.0	60	40
10.0	5	95
15.0	5	95
15.1	90	10
20.0	90	10

(3) 유속: 0.3 mL/분

(4) 컬럼온도: 40℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode:ESI(Positive, Negative)

(2) Capillary temperature:500℃

(3) Capillary voltage:3.8 kV(Positive), 2.6 kV(Negative)

(4) Collision gas:Ar(아르곤)

(5)분석대상물질의 개별조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화(Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	날리딕스산 (Nalidixic acid)	6.77	Positive	232.08	233	104 187 215	36 25 12
2	노르플록사신 (Norfloxacin)	3.27	Positive	319.13	320	233 276 302	20 15 20
3	다노플록사신 (Danofloxacin)	3.56	Positive	357.14	358	231 314 340	30 15 20
4	데하이드로콜산 (Dehydrocholic acid)	7.41	Negative	401.10	401	215 249 331	30 32 23
5	독시싸이클린 (Doxycycline)	5.05	Positive	444.15	445	267 321 428	34 29 16
6	디아베리딘 (Diaveridine)	2.83	Positive	260.13	261	81 123 245	40 25 28
7	디플록사신 (Difloxacin)	4.21	Positive	399.13	400	299 356 382	25 20 20
8	린코마이신 (Lincomycin)	2.76	Positive	406.21	407	126 172 359	30 20 18
9	마보플록사신 (Marbofloxacin)	3.11	Positive	362.13	363	72 320 345	20 15 20
10	메벤다졸 (Mebendazole)	6.46	Positive	295.09	296	104 165 264	30 40 20
10-1	메벤다졸 아민 (Mebendazole amine)	4.51	Positive	237.09	238	105 133 160	25 30 25
10-2	5-하이드록시 메벤다졸 (5-hydroxy mebendazole)	4.50	Positive	297.11	298	79 160 266	35 35 20
11	미노싸이클린 (Minocycline)	3.02	Positive	457.18	458	283 352 441	43 28 15
12	벤질페니실린 (Benzylpenicillin, Penicillin G)	6.58	Positive	334.09	335	114 160 176	30 15 15
13	비치오놀 (Bithionol)	10.4	Negative	354.90	355	161 163 194	28 28 25
14	설파구아니딘 (Sulfaguanidine)	1.13	Positive	214.05	215	60 92 156	12 10 5
15	설파독신 (Sulfadoxine)	5.00	Positive	310.07	311	92 108 156	28 24 16
16	설파디메톡신 (Sulfadimethoxine)	5.96	Positive	310.07	311	92 108 156	28 26 18
17	설파디아진 (Sulfadiazine)	2.63	Positive	250.05	251	92 108 156	26 22 14
18	설파메라진 (Sulfamerazine)	3.33	Positive	264.06	265	92 108 156	24 22 16
19	설파메타진 (Sulfamethazine)	3.87	Positive	278.08	279	92 124 186	28 22 16
20	설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole)	5.02	Positive	253.05	254	92 108 156	26 20 14
21	설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxypyridazine)	3.97	Positive	280.06	281	92 108 156	30 25 14
22	설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine)	4.45	Positive	280.06	281	92 108 156	28 24 16
23	설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline)	5.98	Positive	300.06	301	92 108 156	22 22 17
24	설파클로르피라진 (Sulfachlorpyrazin,Sulfaclozine)	4.66	Positive	284.01	285	92 108 156	26 24 14
25	설파클로르피리다진 (Sulfachlorpyridazine)	5.85	Positive	284.01	285	92 108 156	24 22 14
26	설파티아졸 (Sulfathiazole)	2.91	Positive	255.01	256	92 108 156	24 22 15
27	설파페나졸 (Sulfaphenazole)	6.08	Positive	314.08	315	92 158 160	34 28 22
28	설피속사졸 (Sulfisoxazole)	5.33	Positive	267.06	268	92 113 156	31 16 14
29	세파드록실 (Cefadroxil)	1.60	Positive	363.08	364	114 208	15 10
30	세팔렉신 (Cefalexin)	3.14	Positive	347.09	348	106 158 174	26 10 14
31	세프티오퍼 (Ceftiofur)	5.57	Positive	523.02	524	95 125 241	42 58 16
31-1	데스후로일세프티오퍼 (Desfuroylceftiofur)	4.55	Positive	429.02	430	128 259 368	25 18 15
32	스피라마이신 (Spiramycin)	4.55	Positive	842.51	422	101 142 174	12 10 18
33	시프로플록사신 (Ciprofloxacin)	3.40	Positive	331.13	332	204 231 245	53 35 19
34	아목시실린 (Amoxicillin)	1.39	Positive	365.10	366	113 133 349	19 31 5
35	암피실린 (Ampicillin)	3.12	Positive	349.11	350	79 106 114	44 17 30
36	에리스로마이신 (Erythomycin)	6.16	Positive	733.46	734	82 158 576	35 25 18
37	에토파베이트 (Ethopabate)	5.84	Positive	237.10	238	136 164 206	25 20 10
37-1	m-페네티딘 (m-phenetidine)	3.04	Positive	137.08	138	65 93 110	20 25 10
38	엔로플록사신 (Enrofloxacin)	3.71	Positive	359.16	360	189 245 286	40 23 32
39	오르메토프림 (Ormethoprim)	3.48	Positive	274.14	275	81 123 259	43 25 27
40	오플록사신 (Ofloxacin)	3.29	Positive	361.14	362	221 261 318	35 28 15
41	옥소린산 (Oxolinic acid)	5.45	Positive	261.06	262	129 160 173	35 28 17
42	옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline)	3.41	Positive	460.14	461	201 337 426	18 40 28
43	올레안도마이신 (Oleandomycin)	5.83	Positive	687.41	688	116 158 544	40 25 15
44	조사마이신 (Josamycin)	7.59	Positive	827.46	828	83 109 174	40 45 34
45	클로람페니콜 (Chloramphenicol)	5.61	Negative	322.01	321	152 194 257	18 12 10
46	클로르테트라싸이클린 (Chlortetracycline)	4.77	Positive	478.11	479	98 154 444	40 24 22
47	클록사실린 (Cloxacillin)	7.89	Positive	435.06	436	159 178 321	10 20 15
48	클린다마이신 (Clindamycin)	4.98	Positive	424.17	426	126 335 377	25 18 15
49	키타사마이신 (Kitasamycin)	6.93	Positive	701.40	772	83 109 174	45 38 30
50	테트라싸이클린 (Tetracycline)	3.72	Positive	444.15	445	154 225 410	24 50 16
51	트리메토프림 (Trimethoprim)	3.18	Positive	290.13	291	123 230 261	30 18 25
52	트리클로르폰 (Trichlorfon)	4.28	Positive	255.92	259	79 109 223	25 18 10
53	티아물린 (Tiamulin)	6.91	Positive	493.32	494	73 119 192	50 40 20
54	티아벤다졸 (Thiabendazole)	2.72	Positive	201.04	202	92 131 175	30 25 25
54-1	5-하이드록시 티아벤다졸 (5-hydroxy thiabendazole)	1.91	Positive	217.03	218	81 108 147	35 30 25
55	티암페니콜 (Thiamphenicol)	3.70	Positive	355.00	354	185 240 290	20 16 12
56	틸미코신 (Tilmicosin)	5.39	Positive	868.56	870	88 126 174	60 55 45
57	페노뷰카브 (Fenobucarb)	8.63	Positive	207.13	208	57 95 152	15 15 5
58	페플록사신 (Pefloxacin)	3.34	Positive	333.14	334	233 290 316	23 16 18
59	푸마길린 (Fumagillin)	9.27	Positive	458.23	459	131 177 233	25 15 12
60	프라지콴텔 (Praziquantel)	8.12	Positive	312.18	313	83 174 203	22 28 14
61	플로르페니콜 (Florfenicol)	5.14	Negative	357.00	356	118 185 336	40 21 13
61-1	플로르페니콜아민 (Florfenicol amine)	1.11	Positive	247.06	248	91 130 230	42 25 10
62	플루메퀸 (Flumequine)	7.03	Positive	261.08	262	99 126 202	54 44 30

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7)정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

가) 정성 및 확인시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 아래 나)항(다)항에서 정량한계가제시된 물질에 한함)에 따르거나식품공전 8.3의 정량시험법에 따라 정량한다. 단, 부적합 판정은 8.3의 정량시험법에 의한 결과가 우선한다.

나) 다)의 정량이 가능한 동물용의약품(정량한계 표시)의 경우,조직표준곡선(tissuestandard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blanksample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을제조한다. 각 농도별 첨가시료에서얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도, 시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여정량한다.

다) 정량한계

구분		정량한계
계열	동물용의약품	넙치	장어	새우
린코사마이드계	린코마이신	0.001	0.001	-
	클린다마이신	0.005	0.005	-
마크로라이드계	스피라마이신	-	-	-
	에리스로마이신	0.001	0.001	-
	올레안도마이신	0.01	0.01	0.01
	조사마이신	0.001	0.001	0.001
	틸미코신	0.01	0.01	0.01
	키타사마이신	-	-	-
벤조이미다졸계	메벤다졸	0.01	0.01	0.01
	메벤다졸 아민	0.01	0.01	0.01
	5-하이드록시 메벤다졸	0.01	0.01	0.01
	티아벤다졸	0.01	0.01	0.01
	5-하이드록시 티아벤다졸	0.01	0.01	0.01
설파계	설파구아니딘	0.005	0.005	0.005
	설파독신	0.001	0.001	0.001
	설파디메톡신	0.001	0.001	0.001
	설파디아진	0.001	0.001	0.001
	설파메라진	0.001	0.001	0.001
	설파메타진	0.001	0.001	0.001
	설파메톡사졸	0.001	0.001	0.001
	설파메톡시피리다진	0.001	0.001	0.001
	설파모노메톡신	0.001	0.001	0.001
	설파퀴녹살린	0.001	0.001	0.001
	설파클로르피리다진	0.001	0.001	0.001
	설파클로르피라진	0.001	0.001	0.001
	설파티아졸	0.001	0.001	0.001
	설파페나졸	0.001	0.001	0.001
	설피속사졸	0.001	0.001	0.001
세팔로스포린계	세파드록실	0.001	0.001	-
	세팔렉신	0.005	0.005	0.005
	세프티오퍼	-	-	-
	데스후로일세프티오퍼	-	-	-
퀴놀론계	날리딕스산	0.0001	0.0001	0.0001
	노르플록사신	0.0007	0.0007	0.0007
	다노플록사신	0.01	0.01	0.01
	디플록사신	0.001	-	-
	마보플록사신	0.0001	0.0001	0.0001
	시프로플록사신	0.0001	0.0001	0.0001
	엔로플록사신	0.0001	0.0001	0.0001
	오플록사신	0.0002	0.0002	0.0002
	옥소린산	0.0001	-	0.0001
	페플록사신	0.0007	0.0007	0.0007
	플루메퀸	-	-	-
테트라싸이클린계	독시싸이클린	0.005	0.005	0.005
	옥시테트라싸이클린	0.001	0.001	0.001
	클로르테트라싸이클린	0.001	0.001	0.001
	테트라싸이클린	0.001	-	0.001
	미노싸이클린	0.01	-	0.01
페니실린계	벤질페니실린	0.01	0.01	0.01
	아목시실린	0.005	-	-
	암피실린	0.005	0.005	0.005
	클록사실린	0.01	0.01	0.01
페니콜계	플로르페니콜	-	-	-
	플로르페니콜아민	-	-	-
	티암페니콜	-	-	-
	클로람페니콜	-	-	-
기타	데하이드로콜산	0.005	0.005	0.005
	디아베리딘	0.01	0.01	0.01
	비치오놀	-	-	-
	에토파베이트	0.01	0.01	0.01
	m-페네티딘	0.01	0.01	0.01
	오르메토프림	-	-	-
	트리메토프림	0.001	0.001	0.001
	트리클로르폰	0.001	0.001	-
	티아물린	0.001	0.001	-
	페노뷰카브	0.001	0.001	0.001
	푸마길린	-	-	-
	프라지콴텔	0.001	0.001	0.001

(단위: mg/kg)

※ 정성만 가능한 물질은 ‘-’로 표시