2.2.2.14 콜린

가. 이온크로마토그래프에 의한 정성 및 정량(제1법)

1) 시험법 적용범위

영아용조제식, 성장기용조제식, 조제유류 등에 적용한다.

2) 분석원리

식품에 함유된 콜린(분자량 : 104.17)을 염산으로 분해·추출하고, 양이온 교환수지 컬럼으로 분리한 후 화학적 서프레서-전기전도도 검출기(supressor-conductivity detector)를 사용하여 분석한다.

3) 장치

이온크로마토그래프/화학적 서프레서-전기전도도 검출기(supressor-conductivity detector)

4) 시약 및 시액

가) 표준물질 : 주석산수소콜린(Choline bitartrate, C9H19NO7, 분자량 : 253.25)

나) 증류수 : 이온전도도가 18 mΩ/cm 이상인 것

다) 1 M 염산

라) 표준원액 : 표준물질(순도 99% 이상)을 증류수에 녹여 콜린으로써 1,000 mg/L가 되도록 조제한다.(주석산수소콜린 243 mg을 증류수 100 mL에 녹여 조제한다.)

마) 표준용액 : 표준원액을 증류수로 희석하여 10 mg/L로 조제한다.(사용 시 제조)

바) 검량곡선 표준용액 : 표준용액을 증류수로 희석하여 정량하기에 적합한 농도로 3개 이상 조제한다.(사용 시 제조)

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 HPLC용

5) 시험용액의 조제

균질화한 검체 0.5 g(액상 5 g)을 50 mL 튜브에 정확히 칭량하고, 1 M 염산을 15 mL 첨가하여 시료를 녹인다. 70℃ 수욕상에서 3시간 분해·추출하며, 시료가 충분히 섞일 수 있도록 1시간 간격으로 섞어준다. 추출이 끝나면 실온으로 냉각한 후 여과지를 이용하여 여액을 50 mL 정용플라스크에 모으고 증류수를 이용하여 정용한다. 0.2 µm 나일론 멤브레인 필터로 여과한 후 여액을 증류수로 희석하여 시험용액으로 사용한다.

6) 시험방법

가) 이온크로마토그래프의 조건

(1) 칼럼 : IonPac CG 12A Guard(4×50 mm) 또는 이와 동등한 것 및 IonPac CS 12A Analytical(4×250 mm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상(Isocratic elution) : 18 mM 황산 수용액

(3) 이동상 유속 : 1.0 mL/min

(4) 주입량 : 100 µL

(5) 서프레서 : Cation electrolytically regenerated suppressor(CERS) 500, 4 m 또는 이와 동등한 것

(6) 검출기 : DS6 heated conductivity cell

나) 검량선 작성

검량곡선표준용액을 이온크로마토그래프에 100 µL씩 각각 주입하여 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크의 넓이를 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램

라) 정량한계 : 0.43 mg/L

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크면적법에 따라 정량한다.

가) 계산방법

콜린 함량(mg/100 kcal) =

Y' : 검량곡선에 대입하여 얻은 시험용액의 농도(mg/L)

V : 시료 추출에 사용된 용액의 부피(L)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험 용액의 희석 배수

나. 액체크로마토그래프-질량분석법(제2법)

1) 시험법 적용범위

영아용조제식, 성장기용조제식, 조제유류 등에 적용한다.

2) 분석원리

식품에 함유된 콜린(분자량 : 104.17)을 염산으로 추출하고, HILIC 컬럼으로 분리한 후 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)를 이용하여 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 표준물질 : 주석산수소콜린(Choline bitartrate, C9H19NO7, 분자량 : 253.25)

나) 증류수 : 이온전도도가 18 mΩ/cm 이상인 것

다) 1 M 염산

라) 표준원액 : 표준물질(순도 99% 이상)를 증류수에 녹여 콜린으로써 1,000 mg/L가 되도록 조제한다.(주석산수소콜린 243 mg을 증류수로 100 mL에 녹여 조제한다.)

마) 표준용액 : 표준원액을 증류수로 희석하여 1 mg/L로 조제한다. (사용 시 제조)

바) 검량곡선 표준용액 : 표준용액을 증류수로 희석하여 정량하기에 적합한 농도로 3개 이상 조제한다.(사용 시 제조)

사) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 HPLC용

5) 시험용액의 조제

균질화한 검체 0.5 g(액상 5 g)을 50 mL 튜브에 정확히 칭량하고, 1 M 염산을 15 mL 첨가하여 시료를 녹인다. 70℃ 수욕상에서 3시간 추출하며, 추출 시 시료가 충분히 섞일 수 있도록 1시간 간격으로 섞어준다. 분해가 끝나면 실온으로 냉각한 후 여과지를 이용하여 여액을 50 mL 정용플라스크에 모으고 증류수를 이용하여 정용한다. 0.2 µm 나일론 멤브레인 필터로 여과한 후 여액을 증류수로 희석하여 시험용액으로 사용한다.

6) 시험방법

가) 액체크로마토그래프-질량분석기의 조건

(1) 칼럼 : HILIC(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) (2.1×100 mm, 1.7µm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A : 0.2% 포름산이 함유된 5 mM 포름산암모늄 - 50% 아세토니트릴 용액(5 mM ammonium formate in ACN, 0.2% formic acid)

(나) 이동상 B : 0.2% 포름산이 함유된 30 mM 포름산암모늄 - 50% 아세토니트릴 용액(30 mM ammonium formate in ACN, 0.2% formic acid)

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	100	0
1.0	100	0
1.5	0	100
3.0	100	0
4.2	100	0

(3) 이동상 유량 : 0.5 mL/min

(4) 칼럼온도 : 40℃

(5) 주입량 : 2 µL

(6) 이온화 : ESI positive

(7) MS 정성 및 정량 이온 : 104.1 → 60.2, 45.2

나) 검량선 작성

검량곡선표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 m/z 60.2 이온의 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

다) 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램

라) 정량한계 : 0.018 mg/L

7) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

8) 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크면적법에 따라 정량한다.

가) 계산방법

콜린 함량(mg/100 kcal) =

Y' : 검량곡선에 대입하여 얻은 시험용액의 농도(mg/L)

V : 시료 추출에 사용된 용액의 부피(L)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험 용액의 희석 배수