8.2.2.1.2 축산물 중 구충제 동시 다성분 시험법

1) 시험법 적용범위

축산물에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 황산마그네슘(MgSO4) 및 일차이차아민(Primary Secondary Amine, PSA)로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을 메탄올 또는 DMSO(Dimethyl-sulfoxide)에 녹여 조제한 용액을표준원액으로 한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 DMSO로 희석하여 사용한다.

마) 내부표준원액: 셀라멕틴(Selamectin) 표준품을 DMSO에녹여 조제한 용액을표준원액으로 한다.

바) 내부표준용액: 내부표준원액을 DMSO로 희석하여 사용한다.

사) 맥바인(macllvaine) 완충용액(pH 2): 0.1 M 구연산(citric acid, anhydrous) 500 mL에 0.2 M 인산나트륨(disodium hrdrogen phosphate) 45 mL넣어pH를 2로맞춘다.

아) 20 mM포름산(formic acid)수용액: 100 mL 용량플라스크에포름산0.125 g을 넣고 물로표시선까지 채운다.

자) 0.1%포름산수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

차) 0.2%포름산함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL을 넣고 메탄올로표시선까지채운다.

카) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 조직(간, 신장),유(乳)

균질화한시료2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 내부표준용액 20 μL를넣는다. 15초간혼합한 후 염화나트륨 1 g을 넣은 후흔들어 섞어 추출하고물 2 mL를 넣고 1분간흔들어 섞어 추출한다. 1% 초산함유 아세토니트릴 10 mL를 넣고 15분간 강하게흔들어 섞어 추출한 후 4,500G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 MgSO4900 mg, PSA 150 mg을 포함한 15 mL 원심분리관에 옮긴 후 30초간 강하게흔들어 섞어 추출하고, 4,500G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 유리튜브에 옮긴다.50℃ 이하에서 감압(또는 질소) 농축한 후 DMSO 500 μL로 녹이고 여과하여시험용액으로 한다.

나) 조직(근육),알(卵)

균질화한시료2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 내부표준용액 20 μL를넣는다. 15초간혼합한 후 염화나트륨 1 g을넣어 흔들어 섞어 추출하고맥바인 완충용액 2 mL를 넣고 1분간흔들어 섞어 추출한다.아세토니트릴:메탄올(9:1, v/v) 혼합용액10 mL를 넣고 15분간 강하게흔들어 섞어 추출한후 4,500G에서10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 MgSO4900 mg, PSA 150 mg을 포함한 15 mL원심분리관에 옮긴 후 30초간 강하게흔들어 섞어 추출하고, 4,500G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을유리튜브에 옮긴다.50℃ 이하에서 감압(또는 질소) 농축한 후 DMSO 500 μL로녹이고 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼:C18(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산및 20 mM 포름산암모늄 함유수용액

(나) 이동상 B: 0.2%포름산함유 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	90	10
0.1	90	10
2.0	5	95
9.0	5	95
10.0	90	10
15.0	90	10

(3) 유속: 0.25 mL/분

(4) 컬럼온도: 40℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(Positive, negative)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: Ar(아르곤)

(4) 분석대상물질의 개별 조건

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision Energy, eV)
1	니클로사미드 (Niclosamide)	5.94	Negative	326.0	325	289	15
						171	26
2	니트록시닐 (Nitroxinil)	4.27	Negative	289.9	289	127	25
						162	10
3	도라멕틴 (Doramectin)	7.62	Positive	898.5	922	778	45
						449	45
4	라폭사니드 (Rafoxanide)	8.60	Negative	624.8	624	127	35
						345	35
5	레바미졸 (Levamisole)	1.70	Positive	204.1	205	178	20
						123	30
6	모란텔 (Morantel)	3.92	Positive	220.1	221	164	25
						111	25
7	목시덱틴 (Moxidectin)	7.68	Positive	639.4	662	467	40
						549	40
8	비치오놀 (Bithionol)	6.13	Negative	355.9	355	163	20
						194	25
9	아바멕틴 (Abamectin)	6.97	Positive	872.5	895.4	751	45
						449	45
10	에마멕틴 (Emamectin)	5.53	Positive	885.5	886.4	158	35
						82	35
11	에프리노멕틴 (Eprinomectin)	6.65	Positive	913.5	937	490	55
						368	55
12	이버멕틴 (Ivermectin)	8.30	Positive	874.5	898	753	45
						609	45
13	옥시클로자니드 (Oxyclozanide)	5.31	Negative	400.9	400	202	20
						364	15
14	클로르설론 (Clorsulon)	3.94	Negative	378.9	378 380	342	3
						344	6
15	클로르플루아주론 (Chlorfluazuron)	6.24	Negative	539.0	540	357	20
						177	40
16	클로산텔 (Closantel)	6.90	Negative	661.9	661	127	50
						345	35
17	피란텔 (Pyrantel)	3.68	Positive	206.1	207	150	30
						109	45
18	프라지콴텔 (Praziquantel)	4.90	Positive	312.2	313	203	15
						174	35
19	플루아주론 (Fluazuron)	5.86	Positive	505.0	506	158	20
						349	20
20	셀라멕틴* (내부표준물질) (Selamectin, IS)	8.35	Negative	769.4	770	333	15
						608	15

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※ 셀라멕틴(Selamectin)은 아버멕틴계 구충제의 내부표준물질임

7)정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고,표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

가) 정성시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 식품공전 8.3의 정량시험법을 따른다.

나) 8.3 정량시험법에 해당물질의 시험법이 없을 경우,조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도, 시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.