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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.89 시프로헵타딘(Cyproheptadine), 더콴텔(Derquantel), 펄리마이신(Pirlimycin)
  • 8.3.89 시프로헵타딘(Cyproheptadine), 더콴텔(Derquantel), 펄리마이신(Pirlimycin)

    1) 시험법 적용범위

    축‧수산물 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    검체 중 분석대상물질을 80% 아세토니트릴로 추출하여 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액: 각 표준품을100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올에 녹여100 mg/L이 되게 한다.

    라) 혼합표준용액: 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한농도가되게 한다.

    마) 0.1% 개미산(formic acid) 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    바) 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

    사)기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    가) 유를 제외한 축‧수산물

    균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 2 g (새우, 장어의 경우 1.5 g)과 80% 아세토니트릴 용액 10 mL을 가하여 15분간 진탕한 후, 2,200G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 10 mL를 넣고 30 초간 진탕한 후 2,200G에서 5분간 원심분리한다. 하층액(아세토니트릴층) 2 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃에서 질소농축한 후 잔류물에 0.1% 개미산/메탄올 혼합용액(1:1, v/v) 0.4 mL를 가하여 녹인 후 0.2 μm 막 여과지(PVDF membrane filter)로여과하여 시험용액으로 한다.

    나) 유

    균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 1.5 g, 초산암모늄 1 g, 80% 아세토니트릴 용액 10 mL를 가하여 15분간 진탕한 후, 2,200G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여헥산 10 mL를 넣고 30 초간 진탕하고 2,200G에서 5분간 원심분리한다. 하층액(아세토니트릴층) 2 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃에서질소농축한 후 잔류물에 0.1% 개미산/메탄올 혼합용액(1:1, v/v) 0.4 mL를가하여 녹인 후 0.2 μm 막 여과지(PVDF membrane filter)로여과하여 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1)칼럼:C18(Kinetex, 2.1 × 50 mm, 1.3 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A : 0.1% 개미산 용액

    (나) 이동상 B : 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    90

    10

    10

    10

    90

    15

    10

    90

    15.1

    90

    10

    18

    90

    10

    (3) 유속 : 0.2 mL/분

    (4) 칼럼온도 : 40℃

    (5) 주입량 : 5 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionization : ESI (Positive)

    (2) Capillary temperature : 250℃

    (3) Collision gas : Ar(아르곤)

    (4) 분석대상물질의 개별 조건

    연번

    물질명

    (Compound)

    머무름 시간(분)

    분자량

    선구이온

    (Precursor

    ion, m/z)

    생성이온

    (Product

    ion, m/z)

    충돌에너지

    (Collision Energy,eV)

    1

    시프로헵타딘

    (Cyproheptadine)

    7.3

    287.4

    288.1

    96.1

    -26

    191.1

    -29

    215.1

    -47

    2

    더콴텔

    (Derquantel)

    6.1

    479.6

    480.3

    462.2

    -25

    405.3

    -32

    148.1

    -44

    3

    펄리마이신

    (Pirlimycin)

    6.0

    410.1

    411.2

    112.2

    -15

    56.1

    -20

    363.1

    -20

    ※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    ※각 생성이온(Production)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의최적값으로 변경하여사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

    7) 정성시험

    가) 정성

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

    주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율(%)

    허용범위

    > 50%

    ≤20%

    > 20%∼≤ 50%

    ≤25%

    > 10%∼≤ 20%

    ≤30%

    나)표준품 크로마토그램

    시프로헵타딘(7.3분)

    더콴텔(6.1분)

    펄리마이신(6.0분)

    그림 1. 시프로헵타딘, 더콴텔, 펄리마이신 표준품의 크로마토그램(각 0.005 mg/L)

    8) 정량시험

    가) 정량

    정성시험과 똑같은 조건에서 표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

    나) 정량한계

    시프로헵타딘(Cyproheptadine) : 0.005 mg/kg

    더콴텔(Derquantel) : 0.0002 mg/kg

    펄리마이신(Pirlimycin) : 0.005 mg/kg