8.3.101 사이로마진(Cyromazine)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 분석대상물질을 개미산 함유 아세토니트릴 용액, 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨으로 추출하고, 일차이차아민(Primary secondary amine), C18, 황산마그네슘으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 100 mL 용량플라스크에 사이로마진 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액: 100 mL 용량플라스크에 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한농도가 되게 한다.

마) 0.1% 개미산(Formic acid) 함유 아세토니트릴 용액: 1,000 mL 용량 플라스크에 개미산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

바) 0.1% 아세트산(Acetic acid) 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사) 0.1% 아세트산 함유 메탄올 용액: 1,000 mL 용량 플라스크에 아세트산1mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액 8 mL를 가한 후 10분간 진탕 혼합한다. 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 4 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 첨가하여 진탕한 후, 4℃에서 2,600G에서 15분간 원심분리하고 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액 7 mL 가하여 10분간 진탕하고 4℃에서 2,600G로15분간 원심 분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 PSA 150 mg, C18, 150 mg과 황산마그네슘 900 mg을 가하여 10분간 진탕한 후 4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 40℃에서 0.3 mL가 될 때까지 질소농축한다. 0.1% 아세트산 용액 : 0.1% 아세트산 함유 메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 2.7 mL를 가하여 진탕한다. 4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리 한 후 상층액을 0.45 μm 막 여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 칼럼: HILIC (Xbridge 2.1 × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1% 아세트산용액

(나) 이동상 B: 0.1% 아세트산 함유 메탄올 용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	60	40
10	60	40

(3) 유속: 0.20 mL/분

(4) 칼럼온도: 35℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization: ESI(Positive)

(2) Capillary Temperature: 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4)분석대상물질의 개별 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간(분)	분자량 (MW)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision Energy,eV)
사이로마진 (Cyromazine)	10.49	166.18	167.14	85.10	23
				68.0	41
				125.2	23

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 정성

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤ 20 %
> 20 % ∼ ≤ 50 %	≤ 25 %
> 10 % ∼ ≤ 20 %	≤ 30 %

나) 표준품 크로마토그램

사이로마진 (1.31분, 0.005 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 똑같은 조건에서 표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

나) 정량한계

사이로마진(Cyromazine) : 0.001 mg/kg