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식품 및 식품첨가물공전
9.10 복어독
가. 시험법 적용범위
복어와 복어 염장품 및 건조가공품 등에 적용한다.
나. 분석원리
껍질과 근육을 균질화한 후 검체 일정량을 비커에 취하여 0.1% 초산용액 또는 초산성 메탄올로 추출하여 수욕 중에서 교반 후 냉각하여 여과한다. 이 액을 마우스에 주입하여 치사시간으로부터 독량을 산출한다.
다. 시약 및 시액
1) 물 : 2차 증류수 및 이와 동등한 것
2) 초산성 메탄올(pH 3.0) : 초산 20 mL에 메탄올 900 mL을 가하여 초산으로 pH 3.0을 맞춘 후 1 L로 한다
3) 0.1% 초산용액 : 초산 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.
4) 기타시약 : 특급
라. 시험용액의 조제
1) 추출
가) 초산 추출법 (복어)
검체는 물과 직접 접촉해서는 아니 되며, 동결상태의 시료는 반동결 상태에서 껍질과 근육을 각각 별도로 분쇄기로 균질화한 후 10 g을 비커에 취하여 0.1% 초산용액 약 25 mL를 가한다. 끓는 수욕 중에서 교반하면서 10분간 가열 후 냉각한다. 원심관에 옮겨 원심분리(5,000 rpm, 5분)하여 추출액을 얻는다. 원심관 내의 잔류물을 0.1% 초산용액으로 세정하고 원심분리(5,000 rpm, 5분)하여 상등액을 추출액과 합한다. 이 액을 여과하고, 0.1% 초산용액으로 50 mL 되게 한 것을 각각의 시험용액으로 한다. 1 mL은 검체 0.2 g에 해당한다. 각각의 시험용액은 마우스 시험 전까지 냉장보관한다.
나) 초산성 메탄올 추출법 (복어 염장품 및 건조가공품 등)
껍질과 근육 각각 별도로 잘게 자르고, 분쇄기로 충분히 균질화한 후 검체 약 10 g과 초산성 메탄올 50 mL을 200 mL 둥근바닥플라스크에 넣고 환류냉각장치를 부착시킨다. 이를 미리 70～75℃로 예열된 전열기에서 10분간 가온하여 추출한다. 냉각 후 추출액을 다른 플라스크에 옮기고 초산성 메탄올 50 mL을 가하여 추출하는 과정을 두 번 반복하고 추출액은 모두 합한다. 잔류물을 초산성메탄올 10 mL로 세정하고 이액을 추출액과 합한 후 여과하여 감압 농축한다. 농축 한 것에 물 10 mL을 가하여 녹인 후, 분액깔때기에 옮기고 에틸에테르 10 mL을 넣어 흔들어 섞은 후 층을 분리하고 에테르 층은 버린다. 다시 물 층에 에틸에테르 10 mL을 넣는 과정을 반복한다. 물층을 40℃ 이상의 수욕상에서 감압하여 에테르를 제거한 후 물을 가해 20 mL 되게 한 것을 각각의 시험용액으로 한다. 1 mL는 검체 0.5 g에 해당한다. 각각의 시험용액은 마우스 시험 전까지 냉장보관 한다.
마. 시험조작 (마우스 시험)
1) 마우스
ICR계 또는 ddy계의 동일계통의 생후 4주된 19～21 g의 건강한 수컷을 사용한다. 시험에 사용한 마우스는 표 2를 이용하여 마우스 체중에 대해 보정한다.
2) 시험
시험용액 1 mL을 2마리의 마우스 복강 내에 주사하고 주사 후부터 사망까지의 시간을 초단위로 기록한다. 사망 시에는 3마리 이상의 마우스를 취하여 복강 내에 주사하여 반수치사시간(50% lethal time, LT50)을 구한다. 다만, 마우스가 7분 이내에 사망한 경우 7～13분 정도에서 사망하도록 시험용액을 희석하고 마우스 복강 내에 주사하여 반수치사시간(50% lethal time, LT50)을 구한다. 희석시에는 증류수를 사용한다.
바. 계산살아남은 것을 포함한 마우스의 반수치사시간(50% lethal time, LT50)으로부터 표 1에 의한 MU를 구한다. 만일 마우스가 19 g이하 혹은 21 g이상이면 표 2에서 각 마우스체중에 대한 MU를 보정한 후 중앙값을 구하여 다음 식에 의해 검체 1 g 당의 MU를 구한다.
독력(MU/g) = 치사시간 및 체중보정에 의한 MU × 희석배수 × V / S
S : 검체의 채취량 (g)
V : 추출(1)법 50 (mL)
추출(2법) 20 (mL)
치사시간
(분)
MU
치사시간
(분)
MU
치사시간
(분)
MU
치사시간
(분)
MU
4：00
4：05
4：10
4：15
4：20
4：25
4：30
4：35
4：40
4：45
4：50
4：55
5：00
5：05
5：10
5：15
5：20
5：25
5：30
5：35
5：40
5.62
5.40
5.19
5.00
4.82
4.66
4.50
4.36
4.23
4.10
3.99
3.88
3.77
3.68
3.58
3.50
3.42
3.34
3.26
3.19
3.13
5：45
5：50
5：55
6：00
6：10
6：20
6：30
6：40
6：50
7：00
7：10
7：20
7：30
7：40
7：50
8：00
8：15
8：30
8：45
9：00
9：15
3.07
3.01
2.95
2.89
2.79
2.70
2.61
2.53
2.46
2.39
2.33
2.27
2.22
2.17
2.12
2.08
2.01
1.96
1.91
1.86
1.81
9：30
9：45
10：00
10：15
10：30
10：45
11：00
11：15
11：30
11：45
12：00
12：15
12：30
12：45
13：00
13：15
13：30
13：45
14：00
14：30
15：00
1.77
1.74
1.70
1.67
1.64
1.61
1.58
1.56
1.53
1.51
1.49
1.47
1.45
1.43
1.42
1.40
1.38
1.36
1.34
1.33
1.30
15：30
16：00
16：30
17：00
17：30
18：00
18：30
19：00
19：30
20：00
20：30
21：00
21：30
22：00
22：30
23：00
23：30
24：00
24：30
25：00
1.28
1.26
1.24
1.23
1.21
1.19
1.18
1.17
1.15
1.14
1.13
1.12
1.11
1.10
1.09
1.08
1.08
1.07
1.06
1.05
<표 2> Mouse 체중 - mouse 단위보정표
mouse체중(g)
MU
mouse체중(ｇ)
MU
mouse체중(ｇ)
MU
12.0
12.5
13.0
13.5
14.0
14.5
15.0
0.60
0.63
0.65
0.67
0.70
0.73
0.75
15.5
16.0
16.5
17.0
17.5
18.0
18.5
0.78
0.80
0.83
0.85
0.88
0.90
0.93
19.0
19.5
20.0
20.5
21.0
21.5
22.0
0.95
0.98
1.00
1.03
1.05
1.08
1.10
ICR계 또는 ddy계의 동일계통의 생후 4주된 19～21 g의 건강한 수컷을 사용한다. 시험에 사용한 마우스는 표 2를 이용하여 마우스 체중에 대해 보정한다.
시험용액 1 mL을 2마리의 마우스 복강 내에 주사하고 주사 후부터 사망까지의 시간을 초단위로 기록한다. 사망 시에는 3마리 이상의 마우스를 취하여 복강 내에 주사하여 반수치사시간(50% lethal time, LT50)을 구한다. 다만, 마우스가 7분 이내에 사망한 경우 7～13분 정도에서 사망하도록 시험용액을 희석하고 마우스 복강 내에 주사하여 반수치사시간(50% lethal time, LT50)을 구한다. 희석시에는 증류수를 사용한다.
치사시간
(분)
MU
치사시간
(분)
MU
치사시간
(분)
MU
치사시간
(분)
MU
4：00
4：05
4：10
4：15
4：20
4：25
4：30
4：35
4：40
4：45
4：50
4：55
5：00
5：05
5：10
5：15
5：20
5：25
5：30
5：35
5：40
5.62
5.40
5.19
5.00
4.82
4.66
4.50
4.36
4.23
4.10
3.99
3.88
3.77
3.68
3.58
3.50
3.42
3.34
3.26
3.19
3.13
5：45
5：50
5：55
6：00
6：10
6：20
6：30
6：40
6：50
7：00
7：10
7：20
7：30
7：40
7：50
8：00
8：15
8：30
8：45
9：00
9：15
3.07
3.01
2.95
2.89
2.79
2.70
2.61
2.53
2.46
2.39
2.33
2.27
2.22
2.17
2.12
2.08
2.01
1.96
1.91
1.86
1.81
9：30
9：45
10：00
10：15
10：30
10：45
11：00
11：15
11：30
11：45
12：00
12：15
12：30
12：45
13：00
13：15
13：30
13：45
14：00
14：30
15：00
1.77
1.74
1.70
1.67
1.64
1.61
1.58
1.56
1.53
1.51
1.49
1.47
1.45
1.43
1.42
1.40
1.38
1.36
1.34
1.33
1.30
15：30
16：00
16：30
17：00
17：30
18：00
18：30
19：00
19：30
20：00
20：30
21：00
21：30
22：00
22：30
23：00
23：30
24：00
24：30
25：00
1.28
1.26
1.24
1.23
1.21
1.19
1.18
1.17
1.15
1.14
1.13
1.12
1.11
1.10
1.09
1.08
1.08
1.07
1.06
1.05
mouse체중(g)
MU
mouse체중(ｇ)
MU
mouse체중(ｇ)
MU
12.0
12.5
13.0
13.5
14.0
14.5
15.0
0.60
0.63
0.65
0.67
0.70
0.73
0.75
15.5
16.0
16.5
17.0
17.5
18.0
18.5
0.78
0.80
0.83
0.85
0.88
0.90
0.93
19.0
19.5
20.0
20.5
21.0
21.5
22.0
0.95
0.98
1.00
1.03
1.05
1.08
1.10