7.1.3.90 발리다마이신-에이(Validamycin-A)

가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를 메탄올 : 물(50 : 50) 혼합액으로 추출한 후 HLB 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

5) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge) : divinylbenzene- N- vinylpyrrolidone copolymer(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약: 잔류농약 시험용 또는 특급

7) 특이사항: 발리다마이신에이는 유리 벽면에 흡착할 가능성이 있으므로 모든 시험과정에서 폴리프로필렌 재질의 용기를 사용한다.

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 5 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 용기에 넣고 메탄올 : 물(50 : 50) 혼합액을 10 mL를 넣어 10분간 강하게 흔들어 추출한 후 4℃, 4,500 G, 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심 분리한다. 상층액을 모두 옮긴 후 메탄올 : 물(50 : 50) 혼합액을 10 mL를 넣어 위 과정을 반복한다(2회). 앞의 여과액과 합친 후 물을 이용하여 부피를 25 mL로 맞춘다.

2) 정제
HLB 카트리지에 3 mL의 메탄올과 물을 차례로 넣어 2～3 방울/초의 속도로 유출시켜버린다. 이어서 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 추출액 5 mL를 카트리지에 넣고 1～2 방울/초의 속도로 용출하여받고 고정상 상단이 노출되기 전에 물 5 mL를 용출하여받는다. 이 과정을 통해 얻은 용액 10 mL를 멤브레인 필터(PVDF, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼 : amide계 컬럼 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 아세토니트릴

(2) 이동상 B : 5 mM 암모늄 아세테이트 함유 물

(3) 농도구배조건

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	100	0
2.5	100	0
2.6	10	90
7.0	10	90
8.0	100	0
10.0	100	0

라) 이동상 유속 : 0.2 mL/분

마) 주입량 : 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary voltage : 3.0 kV

다) Collision gas :아르곤(Ar)

라)액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온(Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
발리다마이신에이 (Validamycin A)	497.5	497.2	498	1781)	23
				336	26

1)정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.발리다마이신에이(4.5분)
* 분석기기 : LC(AcqutiyⓇUPLC), MS/MS(XevoⓇTQ-S),컬럼(XBridgeⓇamide, 2.1 mm I.D. × 100 mm L., 3.5 μm)

5) 정량한계
0.01 mg/kg

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 발리다마이신에이를 확인한다.