7.1.2.5 아바멕틴(Abamectin), 밀베멕틴(Milbemectin), 레피멕틴(Lepimectin)

가. 시험법 적용범위곡류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를 메탄올로 추출한 후 플로리실 컬럼크로마토그래피로 정제하여 액체크로마토그래프로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)

2) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 아바멕틴(B1a및 B1b), 밀베멕틴(A3및 A4) 및 레피멕틴(A3및 A4) 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴에 녹여 적당한 농도로 각각 혼합, 희석한다.

5) 플로리실(Florisil) : 컬럼크로마토그래피용 플로리실(60～100 mesh) 130℃에서 하룻밤 가열한 후 데시케이터에서 보관하여 사용한다.

6) 아미노프로필 카트리지(Amino-propyl cartridge) : 아민(1 g) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

7) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 30 g(곡류, 두류는 20 g)을 정밀히 달아 추출 용기에 넣고(곡류, 두류 등 건조 시료는 물 20 mL를 넣고 2시간 방치) 메탄올 100 mL를 넣어 2～3분간 강하게 흔들어 섞어 추출한다. 이를 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고, 잔류물을 메탄올 40 mL로 씻어 내려 앞의 여과액과 합친다. 합친 여과액을 1 L 용량의 분액깔때기에 옮기고 디클로로메탄 50 mL, 포화염화나트륨용액 50 mL 및 물 450 mL를 넣고 강하게 흔들어 정치하여 층을 분리시킨 후, 디클로로메탄층을 무수황산나트륨에 통과시켜 감압농축플라스크에 받는 과정을 2회 반복한다. 이를 40℃ 이하에서 감압 농축하고, 잔류물을 디클로로메탄 10 mL로 녹인다. ※ 곡류 및 두류 등 지방성 시료의 경우 상기 잔류물을 아세토니트릴포화헥산 50 mL로 녹여 분액깔때기에 옮기고 헥산포화아세토니트릴 50 mL로 2회 분배 추출하여 아세토니트릴층을 40℃ 이하에서 감압 농축하고 디클로로메탄 10 mL에 녹인다.

2) 정제

가) 플로리실 정제 : 안지름 11 mm, 길이 400 mm의 유리컬럼에 플로리실 5 g과 무수황산나트륨을 2 cm 높이로 차례로 충전한 후 디클로로메탄 50 mL를 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 디클로로메탄 용액 10 mL를 고정상 상단에 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 에틸아세테이트 : 디클로로메탄(10 : 90) 혼합액 50 mL를 넣어 유출시켜 버리고 다시 메탄올 : 에틸아세테이트(0.5 : 99.5) 혼합액 50 mL를 넣어 용출하여 감압농축플라스크에 받는다. 이 용출액을 40℃ 이하에서 감압 농축한 후 잔류물을 헥산 10 mL로 녹인다.

나) 아민 카트리지 정제 : 미리 헥산 10 mL로 활성화한 아민 카트리지에 상기 헥산 용액을 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 톨루엔 5 mL를 넣어 유출시켜 버리고 디클로로메탄 10 mL와 아세톤 : 디클로로메탄(20 : 80) 혼합액 5 mL로 2회 용출하여 받는다. 이 용출액을 40℃ 이하에서 감압 농축하고 잔류물에 물 : 아세토니트릴(30 : 70) 혼합액을 넣어 최종부피 2 mL가 되게 한 후 갈색 바이알(Vial)에 담아 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 분석조건

가) 컬럼 : C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 물과 아세토니트릴(30 : 70)의 혼합액

다) 이동상 유속 : 1 mL/분

라) 컬럼 온도 : 40℃

마) 검출파장 : 245 nm

바) 주입량 : 20 μL

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 예시.

1 : 아바멕틴 B1b(13.0분), 2 : 아바멕틴 B1a(17.0분), 3 : 밀베멕틴 A3(16.9분),

4 : 레피멕틴 A3(19.7분), 5 : 밀베멕틴 A4(22.8분), 6 : 레피멕틴 A4(25.8분)

4) 정량한계
아바멕틴 B 1a(0.02 mg/kg), 아바멕틴 B 1b(0.02 mg/kg), 밀베멕틴 A 3(0.02 mg/kg), 밀베멕틴 A 4(0.02 mg/kg), 레피멕틴 A 3(0.02 mg/kg), 레피멕틴 A 4(0.02 mg/kg)

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 아바멕틴, 밀베멕틴 및 레피멕틴을 확인한다.

1) 액체크로마토그래프-질량분석기의 분석조건

가) 컬럼 : C18(2.0 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 물과 아세토니트릴(30 : 70)의 혼합액※ 레피멕틴은 아래 A 및 B의 이동상(40 : 60)을 사용A : 5 mM 포름산암모늄과 0.1% 포름산 함유 물B : 5 mM 포름산암모늄과 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴과 물(90 : 10)의 혼합액

다) 이동상 유속 : 0.4 mL/분

라) 컬럼 온도 : 40℃

마) 주입량 : 2 μL

바) 이온화 : ESI negative-ion mode※ 레피멕틴은 ESI positive-ion mode

사) 분자량 범위 : 300～1,000m/z

아) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	이온 (m/z)
아바멕틴 B1b (AbamectinB1b)	8.0	859.0	857
아바멕틴 B1a (AbamectinB1a)	9.8	873.1	871
밀베멕틴 A3 (MilbemectinA3)	10.6	528.7	527
밀베멕틴 A4 (MilbemectinA4)	13.6	542.7	541
레피멕틴 A3 (LepimectinA3)	6.0	705.8	728
레피멕틴 A4 (LepimectinA4)	6.5	719.9	743