8.3.30클라불라닌산(Clavulanic acid)

1) 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료중 클라불라닌산을 인산완충용액 또는 아세토니트릴로 추출하고 디클 로로메탄으로 지방을 제거하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다 .

3) 측정기기
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 고속액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 표준원액: 표준품을 0.066 M 인산완충용액(pH 6.0)으로 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

다) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록0.066 M 인산완충용액(pH 6.0)으로 희석하여 사용한다.

라) 0.066 M 인산완충용액(pH 6.0): 각각의 100 mL 메스플라스크에 제일인산칼륨(KH2PO4)0.9 g과 제이인산나트륨(Na2HPO4·12H2O) 2.36 g을 넣고 물에 녹여 표시선까지 채운다. 두용액을71:29(v/v)의 비율로 혼합한다.

마) 원심필터 unit: Microcon YM-30 Centrifugal filter device(cut-off 30 kDa) 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 유(乳)균질화한 시료1 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 1 mL를넣고5분간강하게흔들어 섞는다. 이 용액을 1,800G에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하고 디클로로메탄2 mL를넣은 후5분간강하게 흔들어 섞는다.이 용액을 다시 1,800G에서 10분간 원심분리한후 상층액 0.4 mL를 1.5 mL 원심분리관에 옮겨 16,000G에서 10분간 다시 원심분리한 후 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

나) 유(乳)외 식품균질화한 시료 1 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 0.066 M 인산완충용액(pH 6.0) 5 mL를 넣고5분간 강하게 흔들어 섞는다. 이 용액을 1,800G에서 10분간 원심분리한 후 상층액 1 mL를원심분리관에 취하고 다시 16,000G에서 10분간 원심분리한다. 상층액 0.5 mL를 취하고원심필터 unit을 이용하여 4℃, 10,000G에서 30분간 원심분리한 후 하층액을 취하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 컬럼:C8(2.1 mm× 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 컬럼 온도: 35℃

(3) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산 수용액

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	98	2
1.9	98	2
5.0	80	20
12.0	98	2

(4) 유속: 0.25 mL/분

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(negative)

(2) Capillary temperature: 550℃

(3) Collision gas: Ar(아르곤)

(4) Collision energy: 12 eV

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌 에너지 (Collision energy)
클라불라닌산 (Clavulanic acid)	Negative	199.0	198	136 108 112	12

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(production)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에
해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 1 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

클라불라닌산(Clavulanic acid): 0.1 mg/kg (유(乳))

클라불라닌산(Clavulanic acid): 0.02 mg/kg (유(乳)외 식품)