8.3.33덱사메타손(Dexamethasone), 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone),베타메타손(Betamethasone),알도스테론(Aldosterone), 코르티손(Cortisone), 코르티코스테론(Corticosterone), 프레드니손(Prednisone),프레드니솔론(Prednisolone), 플루메타손(Flumethasone)

1) 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고, C 18카트리지로 정 제한 후 액체크로마토그래프/ 질량분석기로 분석한다

3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록10% 아세토니트릴으로 희석하여 사용한다.

마) 3 M 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨 246.1 g을 넣고 물 500 mL로 충분히 녹인 후 초산을 이용하여pH를 4.6으로 맞추고물로 표시선까지 채운다.

바) 20% 아세톤 수용액: 100 mL 용량플라스크에 아세톤을 20 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사) 0.1%포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량 플라스크에포름산1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

아) C18카트리지(6 mL, 500 mg) 또는 이와 동등한 것

자) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 3 M 아세테이트 완충용액(pH 4.6) 10 mL를넣은뒤 흔들어 섞는다. β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-glucuronidase/arylsulfatase) 50 μL를넣고 흔들어 섞어 추출하고60℃ 오븐에 1시간 동안 넣어 둔 후 상온에서 냉각한다. 이 용액에 아세토니트릴 10 mL를넣고5분간흔들어 섞은 뒤0℃에서 5,000G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 이런 과정을 한번 더 반복하여 얻어진 상층액에 헥산 8 mL와 디클로르메탄 2 mL를넣고10분간흔들어 섞는다. 하층액을 취하여50℃ 이하에서 질소 농축하고 잔류물을 메탄올 1 mL과물10 mL로 녹인 것을 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18카트리지에추출액을 흡착시킨다. 물 5 mL, 20% 아세톤 수용액 5 mL, 헥산 5 mL를 차례로유출시켜 버린후진공 감압하여 물을 완전히 제거해준다. 에틸아세테이트 6 mL로용출하여 받고50℃ 이하에서질소 농축한 후 잔류물에 10% 아세토니트릴 1 mL를넣어녹인 후0.2 μm PVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 컬럼:C18(2.1 mm ｘ 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산수용액

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	70	30
7.0	70	30
8.5	10	90
12.0	10	90
14.0	70	30
16.0	70	30

(3) 유속: 0.3 mL/분

(4) 컬럼 온도: 40℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive, negative)

(2) Capillary temperature: 250℃

(3) Capillary voltage: positive(5.0 kV)/negative(3.0 kV)

(4) Collision gas: Ar(아르곤)

(5) 분석대상물질의 개별조건

연번	물질명 (Compound)	머무름시간 (분)	이온화 (Ionizationmode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	덱사메타손 (Dexamethasone)	7.8	Negative	392.2	437.2	292.0	38
						307.1	33
						361.1	20
						391.1	15
2	메틸프레드니솔론 (Methyl prednisolone)	7.0	Negative	374.2	419.2	294.0	38
						309.1	34
						343.1	20
						373.1	14
3	베타메타손 (Betamethasone)	7.4	Negative	392.2	437.2	292.1	37
						307.0	30
						324.8	32
						361.1	20
4	알도스테론 (Aldosterone)	3.8	Positive	360.2	361.2	255.1	17
						315.0	17
						325.1	14
						343.2	15
5	코르티손 (Cortisone)	5.0	Positive	360.2	361.2	105.1	32
						121.1	31
						145.1	30
						163.1	23
6	코르티코스테론 (Corticosterone)	9.2	Positive	346.2	347.2	121.1	25
						293.1	14
						311.2	16
						329.1	12
7	프레드니손 (Prednisone)	4.6	Negative	358.2	403.2	299.1	47
						327.1	20
						357.1	19
						187.0	12
8	프레드니솔론 (Prednisolone)	4.5	Negative	360.2	405.2	187.0	31
						280.1	37
						295.1	32
						329.1	19
9	플루메타손 (Flumethasone)	7.6	Negative	410.2	455.2	305.1	40
						363.1	27
						379.1	20
						409.1	15

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1.프레드니손(4.6분), 프레드니솔론(4.5분), 메틸프레드니솔론(7.1분), 베타메타손(7.4분), 플루메타손(7.8분), 코르티코스테론(9.2분), 코르티손(5.0분), 알도스테론(3.8분) 표준품의 크로마토그램(각 0.001 mg/L)

8) 정량시험

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를고려하여 정량한다.

9) 정량한계

덱사메타손(Dexamethasone): 0.0001 mg/kg

메틸프레드니솔론(Methyl prednisolone): 0.0001 mg/kg

베타메타손(Betamethasone): 0.0001 mg/kg

알도스테론(Aldosterone): 0.005 mg/kg

코르티손(Corticosterone): 0.002 mg/kg

코르티코스테론(Corticosterone): 0.002 mg/kg

프레드니손(Prednisone): 0.0001 mg/kg

프레드니솔론(Prednisolone): 0.0001 mg/kg

플루메타손(Flumethasone): 0.001 mg/kg