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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.36 피페라진(Piperazine)
  • 8.3.36피페라진(Piperazine)

    1) 시험법 적용범위

    축산물 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    시료 중의 피페라진을 2%포름산 수용액으로 추출하고, SPE(PCX) 카트리지로 정제한 후, 액체크로마토그래프/형광검출기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/형광검출기(fluorescence detector)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액: 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

    라) 표준용액: 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록물로 희석하여 사용한다.

    마) SPE 카트리지: Bond Elut Plexa PCX 카트리지(200 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

    바) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    가)유(乳)

    균질화한시료5 mL에 2%포름산 함유아세토니트릴 3 mL를넣은 뒤,20분간흔들어 섞어 추출한다음 2%포름산수용액 12 mL를넣은 뒤,20분간흔들어 섞어 추출한다.이를4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 새로운 tube에 모아40℃ 이하에서17 mL 이하로질소농축한다.미리 메탄올 3 mL와 2%포름산수용액 3 mL로 활성화시킨PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음 2%포름산수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를차례로유출시켜 버린후,5% 메탄올성 수산화암모늄 용액 3 mL로 2회용출하여 받는다.용출액은40℃ 이하에서질소농축한다음, 0.1% 트리에틸아민(TEA) 1 mL로녹이고20분간흔들어 섞어 추출한 후, 아세토니트릴에녹인단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를넣고암실에서 40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여시험용액으로 한다.

    나)알(卵)

    균질화한시료5 mL에 2%포름산함유 아세토니트릴 6 mL를넣은 뒤,20분간흔들어 섞어 추출한다음 2%포름산수용액 10 mL를넣고20분간흔들어 섞어 추출한다. 이를4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 새로운 tube에 모아40℃ 이하에서 10 mL 이하로질소농축한다.미리 메탄올 3 mL와 2%포름산수용액 3 mL로 활성화시킨 PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음 2%포름산수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를 차례로유출시켜 버린후,5% 수산화암모늄 함유 메탄올 3 mL로 2회용출하여 받는다.용출액은40℃ 이하에서질소 농축한다음, 0.1% 트리에틸아민 1 mL로녹이고20분간흔들어 섞어 추출한 후, 아세토니트릴에녹인단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를넣고암실에서40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

    다)유(乳), 알(卵)을 제외한 식품

    균질화한시료5 g에 2%포름산수용액 15 mL를 넣은 뒤, 20분간흔들어 섞어 추출한 다음4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 새로운 tube에 모은다. 남은 침전물에 다시 2%포름산수용액 10 mL를넣고20분간흔들어 섞어 추출한 다음4,000G에서 10분간 원심분리하고상층액을 이전의상층액과 합하여 추출액으로 한다. 미리 메탄올3 mL와 2%포름산수용액 3 mL로 활성화시킨 PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음2%포름산수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를 차례로유출시켜 버린 후, 5% 수산화암모늄 함유 메탄올3 mL로 2회용출하여 받는다.용출액은40℃ 이하에서 질소농축한 다음, 0.1% 트리에틸아민 1 mL로녹이고20분간흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴에녹인단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를넣고암실에서 40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프/형광검출기 측정조건

    (1) 컬럼: C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상:물:아세토니트릴(30:70, v/v) 혼합용액

    (3) 유속: 1.0 mL/분

    (4) 주입량: 20 μL

    (5) 컬럼 온도: 30℃

    (6) 측정파장: 여기파장-338 nm, 측정파장-523 nm

    나) 표준품 크로마토그램

    그림 1. 피페라진(17.4분) 표준품의 크로마토그램

    7) 정량시험

    가) 표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을비교하여 피페라진의 피크 면적으로 검량선을 작성하고 시험용액 중 피페라진 함량을구한다.

    나) 정량한계

       피페라진(Piperazine):0.02 mg/kg

    8) 확인시험

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1) 컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가)이동상 A:0.1% 아세트산 수용액

    (나)이동상 B: 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0.0

    95

    5

    3.0

    95

    5

    5.0

    0

    100

    15.0

    0

    100

    15.1

    95

    5

    20.0

    95

    5

    (3) 유속: 0.2 mL/분

    (4)컬럼온도: 20℃

    (5) 주입량: 10 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionizationmode: ESI(positive)

    (2)Capillary temperature: 350℃

    (3)Capilary voltage: 5,500 V

    (4) Collision gas: N2(질소)

    (5)분석대상물질의 조건

    물질명

    (Compound)

    머무름 시간

    (분)

    이온화

    (Ionization mode)

    관측질량

    (Exact mass)

    선구이온

    (Precursor ion,m/z)

    생성이온

    (Product ion,m/z)

    충돌에너지

    (Collisionenergy, eV)

    피페라진

    (DNS-Cl-piperazine)

    17.4

    Positive

    319.1

    320.1

    170.1

    154.2

    35

    71

    다) 정성 및 확인

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

    주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율

    (Base peak에 대한 %)

    허용범위

    > 50%

    ± 20%

    > 20%, ≤ 50%

    ± 25%

    > 10%, ≤ 20%

    ± 30%