8.3.73루바베그론(Lubabegron) 시험법
1) 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.
2) 분석원리
시료중 분석대상물질을 아세트산 함유아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고 헥산 또는 일차이차아민(PSA)로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.
라) 표준용액:표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.
마)10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨 0.82g을넣고 물로 표시선까지 채운다. 아세트산으로 pH를 4.6으로 맞추고사용한다.
바) 1% 아세트산(acetic acid) 함유아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액: 100 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 표시선까지 채운다.
사)0.1 mM 불화암모늄(ammonium fluoride) 수용액:1,000mL 용량플라스크 불화암모늄 3.7 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
5) 첨가시료의 조제
조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.
6) 시험용액의 조제
균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 10 mM 아세테이트 완충용액 (pH 4.6)2 mL를 넣고 2분간 초음파 처리하여흔들어 섞어 추출한다.β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-glucuronidase/arylsufatase)20 μL를 넣고65℃에서 1시간 중탕한 후 상온에서냉각한다. 이 용액에 1% 아세트산 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v)혼합용액을 12 mL를넣고 10분간 초음파 처리 후 15분간흔들어 섞고4℃에서 9,300G로 10분간 원심분리한다.(㉠돼지고기를 제외한 축수산물의 경우, 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여헥산 12 mL를넣고2분간흔들어 섞는다. 4℃에서 9,300G로 5분간 원심분리한 후 하층액을취하여 감압(또는 질소)농축한다. ㉡돼지고기의 경우, PSA 500 mg이 담겨진 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 5분간흔들어 섞는다.) 4℃에서 9,300G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여감압(또는 질소)농축한다. 잔류물에 50% 메탄올 1 mL를 넣어 녹이고 상온에서 15,800G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.
7) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 컬럼:C18(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm)
또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A: 0.1 mM 불화암모늄수용액
(나) 이동상 B: 메탄올
시간(분) |
A(%) |
B(%) |
0.00 |
50 |
50 |
4.00 |
0 |
100 |
7.00 |
0 |
100 |
7.01 |
50 |
50 |
10.00 |
50 |
50 |
(3) 유속: 0.3 mL/분
(4) 컬럼 온도: 40℃
(5) 주입량: 5 μL
나) 질량분석기 측정조건
(1) Ionization mode: ESI(positive)
(2) Capillary temperature: 300℃
(3) Capillary voltage: 3.6 kV(positive), 2.8 kV(negative)
(4) Collision gas: Ar(아르곤)
(5) 분석대상물질의 조건
물질명 (Compound) |
머무름 시간 (분) |
이온화 (Ionization mode) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온 (Precursor ion,m/z) |
생성이온(Product ion,m/z) |
충돌에너지 (Collision energy, eV) |
루바베그론 (Lubabegron) |
3.3 |
Positive |
499.2 |
500 |
215 |
29 |
250 |
20 |
|||||
251 |
25 |
※밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
8) 정성 및 확인시험
가) 정성 및 확인
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.
주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %) |
허용범위 |
> 50% |
± 20% |
> 20%, ≤ 50% |
± 25% |
> 10%, ≤ 20% |
± 30% |
나) 표준품의 크로마토그램
|