8.3.74 난드롤론(Nandrolone)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중의 분석대상물질을 개미산암모늄이 함유된 아세토니트릴과 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨으로 추출하고 C18과 황산마그네슘으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 난드롤론 표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L이 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

마) 10 mM 개미산암모늄(Ammonium formate)을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 10 mM 개미산암모늄을 함유한 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 0.63 g의 개미산암모늄을 넣고 20 mL의 물로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 10 mM 개미산암모늄을 함유한 아세토니트릴 20 mL을 가하여 5분간 진탕한다. 여기에 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 4 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣고 15분간 진탕한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 상징액을 취하여 C18150 mg과 황산마그네슘 900 mg을 넣고 10분간 진탕한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 상징액을 취하여 40℃에서 0.5 mL이 될 때까지 질소농축하고, 아세토니트릴 1.5 mL에 녹여 4℃, 15,000 G에서 10분간 원심 분리한 후, 0.45 μm 멤브레인 필터(Polytetrafluoroethylene, PTFE)로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 칼럼: Phenomenex Luna C18(2.1 × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A : 10 mM 개미산암모늄을 함유한 물

(나) 이동상 B : 아세토니트릴(ACN)

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	90	10
5	90	10
10	10	90
20	10	90
25	90	10
30	90	10

(3) 유속 : 0.25 mL/분

(4) 칼럼온도 : 30℃

(5) 주입량 : 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization: ESI (Positive)

(2) Capillary Temperature: 350 ℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4) 분석대상물질의 충돌 에너지

물질명 (Compound)	머무름 시간(분)	분자량	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
난드롤론 (Nandrolone)	13.03	274.40	275.240	109.0	33
				81.0	59
				91.0	59

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율이 20～30% 이내에서 일치하여야 한다. ※ 주1 참조

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위(CAC/GL 71-2009)

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50%	≤ 20%
> 20% ~ ≤ 50%	≤ 25%
> 10% ~ ≤ 20%	≤ 30%

나) 표준품 크로마토그램