8.3.80 푸마길린(Fumagillin)
1) 시험법 적용범위
꿀, 어류 등에 적용한다.
2) 분석원리
검체 중 분석대상물질을 물 또는 개미산이 함유된 아세토니트릴로 추출하고 Strata-X 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액 : 표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.
라) 표준용액 : 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.
마) Strata-X 카트리지 : 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것
바) 0.1% 개미산(Formic acid) : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산(Formic acid) 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
사) 0.1% 개미산(Formic acid)을 함유한 메탄올 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산(Formic acid) 1 mL을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.
아) 10 mM 개미산암모늄(Ammonium formate)을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
자) 10 mM 개미산암모늄(Ammonium formate)을 함유한 메탄올 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄 0.63 g을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.
차) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용액의 조제
가) 꿀
균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 증류수를 10 mL 가하여 10분간 진탕한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 미리 메탄올 5 mL과 물 5 mL로 Strata-X 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 40% 메탄올 수용액 5 mL로 2회 세척한다. 새로운 원심 분리관에 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴 6 mL로 용출한 후, 40℃ 이하의 수욕 중에서 질소농축 한다. 잔류물을 0.1% 개미산과 10 mM 개미산암모늄을 함유한 메탄올 1 mL로 재분산하여 1분간 진탕한 후 4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm 필터(Polytetrafluoroethylene, PTFE)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
나) 어류
균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴을 20 mL 가한 후 5분간 진탕한다. 여기에 4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 40℃ 이하의 수욕 중에서 질소농축 하여 0.5 mL이 되게 하고 증류수 5 mL로 재분산한다. 미리 메탄올 5 mL과 물 5 mL로 Strata-X 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 40% 메탄올 수용액 5 mL로 세척한다. 새로운 원심 분리관에 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴 10 mL로 용출한 후, 40℃ 이하의 수욕 중에서 질소농축 한다. 잔류물을 0.1% 개미산과 10 mM 개미산암모늄을 함유한 메탄올 1 mL로 재분산하여 1분간 진탕한 후 4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm 필터( Polytetrafluoroethylene, PTFE)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 칼럼:Phenomenex Luna C18(2.0 × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가)이동상 A : 0.1% 개미산 : 10mM 개미산암모늄을 함유한 물(1:1, v/v)
(나)이동상 B : 0.1% 개미산 : 10mM 개미산암모늄을 함유한 메탄올(1:1, v/v)
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0 |
95 |
5 |
5 |
95 |
5 |
10 |
5 |
95 |
20 |
5 |
95 |
25 |
95 |
5 |
30 |
95 |
5 |
(3) 유속 : 0.2 mL/분
(4) 칼럼온도 : 35℃
(5) 주입량 : 10 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization : ESI(Positive)
(2) Capillary temperature : 350℃
(3) Collision gas : N2(질소)
(4) 분석대상물질의 개별 조건
물질명 (Compound) |
머무름 시간(분) |
분자량 |
선구이온 (Precusor ion, m/z) |
생성이온 (Product ion, m/z) |
충돌에너지 (CollisionEnergy, eV) |
푸마길린 (Fumagillin) |
16.62 |
458.54 |
459 |
131 |
41 |
177 |
21 |
||||
103 |
83 |
※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함
7) 정성시험
가) 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율이 20~30% 이내에서 일치하여야 한다. ※주1 참조
주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율(%) |
허용범위 |
> 50% |
≤ 20% |
20% ~ 50% |
≤ 25% |
> 10% ~ < 20% |
≤ 30% |
나) 표준품 크로마토그램