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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.81 니스타틴(Nystatin), 메토미데이트(Metomidate), 부파바쿠온(Buparvaquone), 아르사닐산(p-Arsanilic acid)
  • 8.3.81 니스타틴(Nystatin), 메토미데이트(Metomidate), 부파바쿠온(Buparvaquone), 아르사닐산(p-Arsanilic acid)

    1) 시험법 적용범위

    축산물 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    검체 중의 분석대상물질을 10 mM 개미산암모늄(Ammonium formate)을 함유한 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기 (LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액 :

    (1) 니스타틴 표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 DMSO (Dimethylsulfoxide)에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.

    (2) 부파바쿠온, 메토미데이트, 아르사닐산 각 표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.

    라) 혼합표준용액 : 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

    마) 10 mM 개미산암모늄(Ammonium formate)을 함유한 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 0.63 g의 개미산암모늄을 넣고 20 mL의 물로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

    바) 0.1% 개미산(Formic acid)을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    사) 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

    아) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM 개미산암모늄이 함유된 아세토니트릴 20 mL을 가하여 15분간 진탕 혼합한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하고 20 mL 헥산을 넣어 10분간 진탕한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 취하고 40℃에서 0.5 mL이 될 때까지 질소농축한다. 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴 0.5 mL을 가한 뒤 재분산하고 4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 0.45 μm 필터(Polytetrafluoroethylene, PTFE)로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1) 칼럼 : Phenomenex Luna (2.1 × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A : 0.1% 개미산을 함유한 물

    (나) 이동상 B : 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    100

    0

    5

    100

    0

    7

    5

    95

    17

    5

    95

    20

    100

    0

    25

    100

    0

    (3) 유속 : 0.2 mL/분

    (4) 칼럼온도 : 40℃

    (5) 주입량 : 10 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionization : ESI(Positive)

    (2) Capillary temperature : 350℃

    (3) Collision gas : N2(질소)

    (4) 분석대상물질의 개별 조건

    연번

    물질명

    (Compound)

    머무름 시간(분)

    분자량

    선구이온

    (Precursor

    ion, m/z)

    생성이온

    (Product

    ion, m/z)

    충돌에너지

    (Collision energy, eV)

    1

    니스타틴

    (Nystatin)

    11.28

    926.09

    926.580

    297.0

    39

    691.3

    33

    673.3

    33

    2

    메토미데이트

    (Metomidate)

    11.72

    230.26

    231.151

    127.1

    13

    95.1

    29

    105.1

    27

    3

    부파바쿠온

    (Buparvaquone)

    16.87

    326.43

    327.225

    189.0

    29

    115.1

    67

    57.1

    53

    4

    아르사닐산

    (p-Arsanilic acid)

    11.74

    217.05

    218.08

    92.3

    19

    109.1

    21

    200.0

    15

    ※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    ※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

    7) 정성시험

    가) 정성

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율이 20~30% 이내에서 일치하여야 한다. ※주1 참조

    주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율(%)

    허용범위

    > 50%

    ≤ 20%

    20% ~ 50%

    ≤ 25%

    > 10% ~ < 20%

    ≤ 30%

    나) 표준품 크로마토그램

    니스타틴 (Nystatin)