8.3.63 아미트라즈(Amitraz)

1) 시험법 적용범위

축산물(벌꿀 제외) 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 분석대상물질을 아세토니트릴, 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨 또는 헥산, 이소프로필알코올, 수산화나트륨으로 추출하여 C18으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

마)10 mM포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 0.1%포름산(formic acid) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

사)0.1 M 수산화나트륨 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 수산화나트륨(NaOH) 4.04 g을 넣고물로 녹여 표시선까지 채운다.

아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용

가) 가금육

균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를넣은 후1분간흔들어 섞는다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을넣은 뒤1분간흔들어 섞고4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다.새로운 15 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 40°C이하에서질소농축한 후 아세토니트릴1 mL를넣고 녹인다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하고 0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 후 시험용액으로 한다.

나) 가금육을 제외한 식육

미리 균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 균질화한 알(아미트라즈및 2,4-디메틸아닐린이 검출되지 않은 알이어야 함) 2 mL, 0.1 M 수산화나트륨용액2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL를넣은 뒤1분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL를넣은 뒤1분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 15 mL 원심분리관에상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 40°C이하에서질소농축하고, 잔류물을 아세토니트릴 0.5 mL로녹이고1분간흔들어 섞는다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

다)알(卵)

균질화한시료2 g을 15 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 0.1 M 수산화나트륨용액2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL를넣고1분간흔들어 섞은 뒤4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL를넣은 뒤1분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 40°C이하에서질소농축하고, 잔류물에아세토니트릴 1 mL를넣고 녹인다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여상층액을 취하고 0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 후 시험용액으로 한다.

라)유(乳)

균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를넣은 후1분간흔들어 섞는다.여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣은 뒤 1분간흔들어 섞은것을 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여PSA 150 mg, C18150 mg, MgSO4900 mg를 담겨진 새로운 15 mL원심분리관에넣은 후1분간흔들어 섞고, 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을취하여 40℃이하에서질소농축한 후 아세토니트릴 1 mL를넣어 녹인다. 이를 5분간초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리한다. 상층액을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)컬럼:C18(2.0 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 10 mM포름산암모늄 수용액

(나) 이동상 B: 0.1%포름산함유 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	90	10
3	0	100
9	0	100
10	90	10
15	90	10

(3) 유속: 0.25 mL/분

(4) 컬럼 온도: 40℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive)

(2) Gas temperature: 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

(4) 분석대상물질의 개별조건

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	아미트라즈 (Amitraz)	9.2	Positive	293.2	294.1	163.20	19
						122.10	43
						107.10	59
2	2,4-디메틸아닐린 (2,4-Dimethylaniline)	6.7	Positive	121.1	122.1	107.10	23
						77.00	39
						105.10	23

※밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

아미트라즈

2,4-디메틸아닐린

그림 1.아미트라즈(9.2분), 2,4-디메틸아닐린(6.7분) 표준품의 크로마토그램 (각 0.005 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g(가금육 및 유) 또는 2 g(가금육을 제외한 식육 및 알)씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

아미트라즈(Amitraz): 0.001 mg/kg(식육:0.005 mg/kg)

2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline): 0.005 mg/kg(식육:0.01 mg/kg)