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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.70 독시싸이클린(Doxycycline), 린코마이신(Lincomycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin),에리스로마이신(Erythromycin), 엔로플록사신(Enrofloxacin), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline),클로르테트라싸이클
  • 8.3.70독시싸이클린(Doxycycline), 린코마이신(Lincomycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin),에리스로마이신(Erythromycin), 엔로플록사신(Enrofloxacin), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline),클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline), 타일로신(Tylosin), 테트라싸이클린(Tetracycline),트리메토프림(Trimethoprim)

    1) 시험법 적용범위

    벌꿀, 로얄젤리 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    시료 중의 분석대상물질을EDTA-Na2 수용액과구연산 수용액으로 추출하고 HLB카트리지를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액: 각 표준품(타일로신의 경우 타일로신 A 표준품을 사용한다)을 메탄올(엔로플록사신, 시프로플록사신은 0.2% 포름산 함유 메탄올)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

    라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

    마) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    바) 0.5 M EDTA-Na2(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) 수용액: 500 mL용량플라스크에 EDTA-Na2dihydrate 93.1 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    사) 0.1 M 구연산(citric acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 구연산 19.2 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    아) 추출용액:0.5 MEDTA-Na2수용액과0.1 M 구연산 수용액을2:8(v/v) 비율로 혼합한다.

    자) 0.04% 암모니아수 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 암모니아 수용액(28%)0.4 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    차) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge): Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidonecopolymer(500 mg) 고정상이 충전되어있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

    카) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    가) 아카시아꿀, 잡화꿀, 밤꿀

    균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 10 mL를넣고10분간흔들어섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 0.45 μmPVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로여과하고이를 추출액으로 한다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 2회유출시켜 버린다.새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04%암모니아수 함유 메탄올3 mL로용출하여 받은 후, 45℃이하에서질소농축한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로녹여 5분간 흔들어 섞은 후4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

    나) 마누카꿀, 로얄젤리

    균질화한시료1 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 7 mL를넣고10분간흔들어섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 새로운 원심분리관에 담고추출용액 8 mL를 넣고 10분간흔들어 섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 0.45 μmPVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하고이를 추출액으로 한다.미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고물 4 mL로 3회유출시켜 버린다.새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴3 mL, 0.04%암모니아수 함유 메탄올3 mL로용출하여 받은 후, 45℃이하에서질소농축한다.잔류물은 메탄올 1 mL로녹여 5분간 흔들어 섞은 후4℃, 15,000G에서 10분간원심분리하고 0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1) 컬럼:C18(2.1 mm × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A:0.1%포름산 수용액

    (나) 이동상 B: 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    30

    70

    10

    30

    70

    (3) 유속: 0.2 mL/분

    (4) 컬럼 온도: 30℃

    (5) 주입량: 2 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionization mode: ESI(positive)

    (2) Capillary temperature: 350℃

    (3) Collision gas: N2(질소)

    연번

    물질명

    (Compounds)

    머무름

    시간

    (분)

    이온화

    (Ionization mode)

    관측질량

    (Exact mass)

    선구이온(Precursor ion,m/z)

    생성이온(Product ion,m/z)

    충돌에너지(Collision energy, eV)

    1

    독시싸이클린

    (Doxycycline)

    1.31

    Positive

    444.2

    445.3

    428

    21

    98

    61

    267

    51

    2

    린코마이신

    (Lincomycin)

    1.26

    Positive

    406.2

    407.3

    126

    37

    359

    21

    125

    73

    3

    시프로플록사신

    (Ciprofloxacin)

    1.28

    Positive

    331.1

    332.2

    314

    23

    231

    47

    288

    19

    4

    에리스로마이신

    (Erythromycin)

    1.29

    Positive

    733.5

    734.5

    158

    43

    83

    73

    116

    61

    5

    엔로플록사신

    (Enrofloxacin)

    1.29

    Positive

    359.2

    360.2

    316

    23

    245

    37

    342

    25

    6

    옥시테트라싸이클린

    (Oxytetracycline)

    1.33

    Positive

    460.4

    461.2

    426

    23

    201

    51

    127

    97

    7

    클로르테트라싸이클린

    (Chlortetracycline)

    1.34

    Positive

    478.1

    479.3

    444

    23

    154

    35

    462

    21

    8

    타일로신 A

    (Tylosin A)

    1.29

    Positive

    915.5

    916.5

    174

    47

    101

    65

    116

    75

    9

    테트라싸이클린

    (Tetracycline)

    1.33

    Positive

    444.2

    445.3

    410

    23

    154

    33

    98

    53

    10

    트리메토프림

    (Trimethoprim)

    1.28

    Positive

    290.1

    291.2

    123

    31

    230

    23

    261

    35

    (4) 분석대상물질의 개별조건

    ※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    7) 정성시험

    가)정성 및 확인

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
    확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

    주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율

    (Base peak에 대한 %)

    허용범위

    > 50%

    ± 20%

    > 20%, ≤ 50%

    ± 25%

    > 10%, ≤ 20%

    ± 30%

    나) 표준품 크로마토그램

    독시싸이클린(Doxycycline)

    린코마이신(Lincomycin)

    시프로플록사신(Ciprofloxacin)

    에리스로마이신(Erythromycin)