8.3.70독시싸이클린(Doxycycline), 린코마이신(Lincomycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin),에리스로마이신(Erythromycin), 엔로플록사신(Enrofloxacin), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline),클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline), 타일로신(Tylosin), 테트라싸이클린(Tetracycline),트리메토프림(Trimethoprim)
1) 시험법 적용범위
벌꿀, 로얄젤리 등에 적용한다.
2) 분석원리
시료 중의 분석대상물질을EDTA-Na2 수용액과구연산 수용액으로 추출하고 HLB카트리지를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액: 각 표준품(타일로신의 경우 타일로신 A 표준품을 사용한다)을 메탄올(엔로플록사신, 시프로플록사신은 0.2% 포름산 함유 메탄올)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.
라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.
마) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.
바) 0.5 M EDTA-Na2(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) 수용액: 500 mL용량플라스크에 EDTA-Na2dihydrate 93.1 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
사) 0.1 M 구연산(citric acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 구연산 19.2 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
아) 추출용액:0.5 MEDTA-Na2수용액과0.1 M 구연산 수용액을2:8(v/v) 비율로 혼합한다.
자) 0.04% 암모니아수 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 암모니아 수용액(28%)0.4 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.
차) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge): Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidonecopolymer(500 mg) 고정상이 충전되어있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것
카) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용액의 조제
가) 아카시아꿀, 잡화꿀, 밤꿀
균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 10 mL를넣고10분간흔들어섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 0.45 μmPVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로여과하고이를 추출액으로 한다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 2회유출시켜 버린다.새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04%암모니아수 함유 메탄올3 mL로용출하여 받은 후, 45℃이하에서질소농축한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로녹여 5분간 흔들어 섞은 후4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
나) 마누카꿀, 로얄젤리
균질화한시료1 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 7 mL를넣고10분간흔들어섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 새로운 원심분리관에 담고추출용액 8 mL를 넣고 10분간흔들어 섞은 후4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. 0.45 μmPVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하고이를 추출액으로 한다.미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고물 4 mL로 3회유출시켜 버린다.새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴3 mL, 0.04%암모니아수 함유 메탄올3 mL로용출하여 받은 후, 45℃이하에서질소농축한다.잔류물은 메탄올 1 mL로녹여 5분간 흔들어 섞은 후4℃, 15,000G에서 10분간원심분리하고 0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 컬럼:C18(2.1 mm × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A:0.1%포름산 수용액
(나) 이동상 B: 아세토니트릴
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0 |
30 |
70 |
10 |
30 |
70 |
(3) 유속: 0.2 mL/분
(4) 컬럼 온도: 30℃
(5) 주입량: 2 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization mode: ESI(positive)
(2) Capillary temperature: 350℃
(3) Collision gas: N2(질소)
연번 |
물질명 (Compounds) |
머무름 시간 (분) |
이온화 (Ionization mode) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온(Precursor ion,m/z) |
생성이온(Product ion,m/z) |
충돌에너지(Collision energy, eV) |
1 |
독시싸이클린 (Doxycycline) |
1.31 |
Positive |
444.2 |
445.3 |
428 |
21 |
98 |
61 |
||||||
267 |
51 |
||||||
2 |
린코마이신 (Lincomycin) |
1.26 |
Positive |
406.2 |
407.3 |
126 |
37 |
359 |
21 |
||||||
125 |
73 |
||||||
3 |
시프로플록사신 (Ciprofloxacin) |
1.28 |
Positive |
331.1 |
332.2 |
314 |
23 |
231 |
47 |
||||||
288 |
19 |
||||||
4 |
에리스로마이신 (Erythromycin) |
1.29 |
Positive |
733.5 |
734.5 |
158 |
43 |
83 |
73 |
||||||
116 |
61 |
||||||
5 |
엔로플록사신 (Enrofloxacin) |
1.29 |
Positive |
359.2 |
360.2 |
316 |
23 |
245 |
37 |
||||||
342 |
25 |
||||||
6 |
옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline) |
1.33 |
Positive |
460.4 |
461.2 |
426 |
23 |
201 |
51 |
||||||
127 |
97 |
||||||
7 |
클로르테트라싸이클린 (Chlortetracycline) |
1.34 |
Positive |
478.1 |
479.3 |
444 |
23 |
154 |
35 |
||||||
462 |
21 |
||||||
8 |
타일로신 A (Tylosin A) |
1.29 |
Positive |
915.5 |
916.5 |
174 |
47 |
101 |
65 |
||||||
116 |
75 |
||||||
9 |
테트라싸이클린 (Tetracycline) |
1.33 |
Positive |
444.2 |
445.3 |
410 |
23 |
154 |
33 |
||||||
98 |
53 |
||||||
10 |
트리메토프림 (Trimethoprim) |
1.28 |
Positive |
290.1 |
291.2 |
123 |
31 |
230 |
23 |
||||||
261 |
35 |
※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
7) 정성시험
가)정성 및 확인
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.
주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %) |
허용범위 |
> 50% |
± 20% |
> 20%, ≤ 50% |
± 25% |
> 10%, ≤ 20% |
± 30% |
나) 표준품 크로마토그램
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독시싸이클린(Doxycycline) |
린코마이신(Lincomycin) |
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시프로플록사신(Ciprofloxacin) |
에리스로마이신(Erythromycin) |
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