7.3.1.10 사이헥사틴(Cyhexatin), 아조사이클로틴(Azocyclotin), 펜뷰타틴 옥사이드(Fenbutatin oxide)
가. 시험법 적용범위
소고기, 돼지고기, 가금류고기, 유, 알 등의 축산물에 적용한다.
나. 분석원리
시료를 1% 아세트산 함유 아세토니트릴 : 에틸아세테이트(1 : 1)로 추출하고 d-SPE (dispersive-Solid Phase Extraction)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.
※ 아조사이클로틴은 분석과정 중 사이헥사틴으로 전환됨
다. 장치
1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)
라. 시약 및 시액
1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : 사이헥사틴, 펜뷰타틴 옥사이드 표준품을 아세톤에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.
4) 표준용액 : 각 물질의 표준원액 100 mg/L을 메탄올에 적당한 농도로 혼합하여 희석한다. 희석한 용액은 정량 시 조직표준곡선(Tissue standard curve) 작성을 위해 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성대조시료(Blank sample)에 공시료를 포함하여 5개 이상 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.
5) d-SPE : C18(octadecyl bonded silica), 1차 2차 아민(PSA, Primary Secondary Amine)
6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급
마. 시험용액의 조제
1) 추출
균질화한 시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고 1% 아세트산 함유 아세토니트릴 : 에틸아세테이트(1 : 1) 혼합액 10 mL를 넣어 30분간 강하게 흔들어 추출한다. 여기에 무수황산마그네슘 4 g과 염화나트륨 1 g을 넣어 1분간 흔들어 섞은 후 4℃, 4,000G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다.
2) 정제
C18250 mg과 1차 2차 아민 100 mg이 담긴 15 mL 용량 원심분리관에 ‘1) 추출’ 로부터 얻은 상층액 5 mL를 넣어 1분간 강하게 흔든 후 원심분리 등의 방법으로 층을 분리한다. 새로운 15 mL 용량 원심분리관에 상층액 3 mL를 취하여 40℃에서 질소를 이용하여 농축한다. 농축 후 1% 포름산과 5 mM 포름산 암모늄이 첨가된 메탄올 1.5 mL를 넣고 5분간 초음파 처리하여 충분히 녹이고, 5분간 흔들어 섞는다. 원심분리 등의 방법으로 층을 분리한 후 상층액을 멤브레인필터 (PTFE, 0.2 μm)로 여과하여 시험용액으로 한다.
바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프의 분석조건
가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것
나) 컬럼 온도 : 40℃
다) 이동상
(1) 이동상 A : 1% 포름산 및 5 mM 포름산 암모늄 함유 물
(2) 이동상 B : 1% 포름산 및 5 mM 포름산 암모늄 함유 메탄올
(3) 농도구배조건
시간(분) |
A(%) |
B(%) |
0.0 |
60 |
40 |
2.0 |
0 |
100 |
5.0 |
0 |
100 |
5.1 |
60 |
40 |
8.0 |
60 |
40 |
라) 이동상 유속 : 0.4 mL/분
마) 주입량 : 10 μL
2) 질량분석기 분석조건
가) 이온화 : ESI positive-ion mode
나) Capillary voltage : 3.7 kV
다) Collision gas : 아르곤(Ar)
라) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온
분석성분 (Compound) |
머무름 시간 (min) |
분자량 (MW) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온 (Precursor ion,m/z) |
생성이온(Product ion,m/z) |
충돌에너지 (Collision energy, eV) |
사이헥사틴 (Cyhexatin) |
3.2 |
386.2 |
387.2 |
369 |
2051) |
17 |
81 |
28 |
|||||
펜뷰타틴 옥사이드 (Fenbutatin oxide) |
3.6 |
1052.7 |
1052.4 |
519 |
1971) |
55 |
351 |
33 |
1)정량이온
3) 검량선의 작성
조직표준곡선 (Tissue standard curve)에 사용되는 표준용액을 농도별로 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.
4) 표준품의 크로마토그램
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