8.3.82 나이트록소린(Nitroxoline)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중의 분석대상물질을 10 mM 개미산암모늄이 함유된 아세토니트릴과 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨으로 추출하고 C18과 황산마그네슘으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 0.1% 삼불화초산을 함유한 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 0.1% 삼불화초산을 함유한 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

마) 0.1% 삼불화초산(Trifluroacetic acid, TFA)이 함유된 메탄올 : 1,000 mL 용량플라스크에 삼불화초산 1 mL을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

바) 0.1% 삼불화초산이 함유된 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 삼불화초산 1 mL을 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

사) 10 mM 개미산암모늄(Ammonium formate)이 함유된 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 0.63 g의 개미산암모늄을 넣고 20 mL의 물로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

아) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 10 mM 개미산암모늄이 함유된 아세토니트릴 20 mL을 가하여 5분간 진탕 혼합한다. 여기에 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 4 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣어 15분간 진탕한 후, 4℃, 2,600 G에서 15분간 원심 분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취하고, C18150 mg과 황산마그네슘 900 mg을 넣어 10분간 진탕한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 상층액을 15 mL 원심분리관에 취하여 40℃에서 0.5 mL이 될 때까지 질소농축한다. 0.1% 삼불화초산이 함유된 아세토니트릴 1.5 mL을 가한 뒤 재분산하고 4℃, 15,000G에서 10분간 원심 분리하여 0.45 μm 필터(Polytetrafluoroethylene, PTFE)로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 칼럼 : Phenomenex Luna C
18(2.1 × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A : 0.1% 삼불화초산을 함유한 물

(나) 이동상 B : 0.1% 삼불화초산을 함유한 아세토니트릴(ACN)

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
6	5	95
13	5	95
15	95	5
20	95	5

(3) 유속 : 0.25 mL/분

(4) 칼럼온도 : 30℃

(5) 주입량 : 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization : ESI(Positive)

(2) Capillary temperature : 350℃

(3) Collision gas : N2(질소)

(4) 분석대상물질 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간(분)	분자량	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collisionenergy, eV)
나이트록소린 (Nitroxoline)	9.10	190.156	191.154	145.1	27
				127.0	43
				117.1	41

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 정성

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율이 20～30% 이내에서 일치하여야 한다 ※주1 참조

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50%	≤ 20%
20% ～ 50%	≤ 25%
> 10% ～ < 20%	≤ 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 니트로소린 (9.10분) 표준품의 크로마토그램 (0.01 mg/kg)

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 똑같은 조건에서 표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

나) 정량한계

나이트록소린(Nitroxoline) : 0.005 mg/kg