8.3.93 틸바로신(Tylvalosin)
1) 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.
2) 분석원리
검체 중분석대상물질을0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액으로 추출하여헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액: 틸바로신, 3-AT (3-O-acetyltylosin, 틸바로신 대사체)표준품을100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.
라) 혼합표준용액: 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한농도가되게 한다.
마) 0.1% 개미산(Formic acid) 함유 아세토니트릴 용액: 1,000 mL 용량플라스크에개미산 1 mL을 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.
바) 10 mM 개미산암모늄 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄(Ammonium formate) 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용액의 조제
균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액 7.5 mL를 가한다. 이를 10분간 진탕한 후 4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액 7.5 mL를 가하고 10분간 진탕한 후 4℃에서 2,600G로15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 가하여 10분간 진탕하고 4℃에서 2,600G로15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃ 수용액상에서 0.3 mL가 될 때까지 질소농축한다. 10 mM 개미산암모늄 용액:아세토니트릴(1:1,v/v) 혼합용액1.7 mL를 가하여 진탕한다. 4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리 한 후 상층액을 0.45 μm 막 여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1)칼럼:C18(Phenomenex Luna 2.0 × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A: 10 mM 개미산암모늄 용액
(나)이동상 B: 아세토니트릴
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0 |
90 |
10 |
3 |
90 |
10 |
5 |
10 |
90 |
13 |
10 |
90 |
15 |
90 |
10 |
20 |
90 |
10 |
(3) 유속: 0.25 mL/분
(4) 칼럼온도: 35℃
(5) 주입량: 10 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization: ESI(Positive)
(2)Capillary Temperature: 350℃
(3) Collision gas: N
2(질소)
물질명 (Compound) |
머무름 시간(분) |
분자량 (MW) |
선구이온 (Precursor ion, m/z) |
생성이온 (Product ion, m/z) |
충돌에너지 (Collision Energy,eV) |
틸바로신 (Tylvalosin) |
10.49 |
1042.25 |
1042.5 |
109.2 |
75 |
174.1 |
59 |
||||
229.1 |
47 |
||||
3-AT (3-O-acetyltylosin) |
10.07 |
958.14 |
958.6 |
772.0 |
45 |
772.5 |
41 |
※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
※각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로변경하여 사용할 수 있으며,제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함
7) 정성시험
가) 정성
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과시험용액의 생성이온간 반응세기의비율(Response ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율(%) |
허용범위 |
> 50 % |
≤ 20 % |
> 20 % ∼ ≤ 50 % |
≤ 25 % |
> 10 % ∼ ≤ 20 % |
≤ 30 % |
나) 표준품 크로마토그램
|
틸바로신(11.2분) |
|