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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.93 틸바로신(Tylvalosin)
  • 8.3.93 틸바로신(Tylvalosin)

    1) 시험법 적용범위

    축산물 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    검체 중분석대상물질을0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액으로 추출하여헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액: 틸바로신, 3-AT (3-O-acetyltylosin, 틸바로신 대사체)표준품을100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.

    라) 혼합표준용액: 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한농도가되게 한다.

    마) 0.1% 개미산(Formic acid) 함유 아세토니트릴 용액: 1,000 mL 용량플라스크에개미산 1 mL을 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

    바) 10 mM 개미산암모늄 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄(Ammonium formate) 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    균질화된 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액 7.5 mL를 가한다. 이를 10분간 진탕한 후 4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 개미산 함유 아세토니트릴 용액 7.5 mL를 가하고 10분간 진탕한 후 4℃에서 2,600G로15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 가하여 10분간 진탕하고 4℃에서 2,600G로15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃ 수용액상에서 0.3 mL가 될 때까지 질소농축한다. 10 mM 개미산암모늄 용액:아세토니트릴(1:1,v/v) 혼합용액1.7 mL를 가하여 진탕한다. 4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리 한 후 상층액을 0.45 μm 막 여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1)칼럼:C18(Phenomenex Luna 2.0 × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A: 10 mM 개미산암모늄 용액

    (나)이동상 B: 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    90

    10

    3

    90

    10

    5

    10

    90

    13

    10

    90

    15

    90

    10

    20

    90

    10

    (3) 유속: 0.25 mL/분

    (4) 칼럼온도: 35℃

    (5) 주입량: 10 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionization: ESI(Positive)

    (2)Capillary Temperature: 350℃

    (3) Collision gas: N
    2(질소)

    물질명

    (Compound)

    머무름 시간(분)

    분자량

    (MW)

    선구이온

    (Precursor

    ion, m/z)

    생성이온

    (Product

    ion, m/z)

    충돌에너지

    (Collision Energy,eV)

    틸바로신

    (Tylvalosin)

    10.49

    1042.25

    1042.5

    109.2

    75

    174.1

    59

    229.1

    47

    3-AT

    (3-O-acetyltylosin)

    10.07

    958.14

    958.6

    772.0

    45

    772.5

    41

    (4) 분석대상물질의 개별 조건

    ※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    ※각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로변경하여 사용할 수 있으며,제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

    7) 정성시험

    가) 정성

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과시험용액의 생성이온간 반응세기의비율(Response ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

    주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율(%)

    허용범위

    > 50 %

    ≤ 20 %

    > 20 % ∼ ≤ 50 %

    ≤ 25 %

    > 10 % ∼ ≤ 20 %

    ≤ 30 %

    나) 표준품 크로마토그램

    틸바로신(11.2분)