8.3.100 아미트라즈(Amitraz)
1) 시험법 적용범위
축산물(벌꿀 제외) 등에 적용한다.
2) 분석원리
검체 중 분석대상물질을 아세토니트릴, 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨 또는 헥산, 이소프로필알코올, 수산화나트륨으로 추출하여 C18으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액 : 100 mL 용량플라스크에 아미트라즈, 2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline, 아미트라즈대사체)표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.
라) 혼합표준용액 : 100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.
마) 10 mM 개미산암모늄(ammonium formate) 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
바) 0.1% 개미산(formic acid) 함유 메탄올 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.
사) 0.1 M 수산화나트륨용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 수산화나트륨(NaOH) 4.04 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.
아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용
가) 가금육
균질화한 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL을 가한 후 1분간 진탕한다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 가한 뒤 1분간 진탕하고 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 새로운 15 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 40°C 수용액상에서 질소농축한 후 아세토니트릴 1 mL를 가하여 재분산한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하고 0.2 µm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 후 시험용액으로 한다.
나) 가금육을 제외한 식육
미리 균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 균질화된 알(아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린이 검출되지 않은 알이어야 함) 2 mL, 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 15 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 40°C에서 질소농축하고, 잔류물을 아세토니트릴 0.5 mL로 재분산하여 1분간 진탕한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.
다) 알
균질화한 검체 2 g을 15 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 40°C 수용액상에서 질소농축한 후 아세토니트릴 1 mL를 가하여 재분산한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하고 0.2 µm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 후 시험용액으로 한다.
라) 유
균질화한 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL을 가한 후 1분간 진탕한다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 가한 뒤 1분간 진탕한 것을 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 150 mg PSA, 150 mg C18, 900 mg MgSO4를 담겨진 새로운 15 mL 원심분리관에 넣은 후 1분간 진탕하고, 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 40℃ 수용액상에서 질소농축한 후 아세토니트릴 1 mL를 가하여 재분산한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리한다. 상층액을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 칼럼: C18(Phenomenex Luna, 2.0 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A : 10 mM 개미산암모늄 용액
(나) 이동상 B : 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0 |
90 |
10 |
3 |
0 |
100 |
9 |
0 |
100 |
10 |
90 |
10 |
15 |
90 |
10 |
(3) 유속: 0.25 mL/분
(4) 칼럼온도: 40℃
(5) 주입량: 10 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization: ESI (Positive)
(2) Gas Temperature: 350℃
(3) Collision gas: N2(질소)
(4) 분석대상물질의 개별 조건
연번 |
물질명 (Compound) |
머무름 시간(분) |
분자량 (MW) |
선구이온 (Precursor ion, m/z) |
생성이온 (Product ion, m/z) |
충돌에너지 (Collision Energy, eV) |
1 |
아미트라즈 (Amitraz) |
9.2 |
293.41 |
294.13 |
163.20 |
19 |
122.10 |
43 |
|||||
107.10 |
59 |
|||||
2 |
2,4-디메틸아닐린 (2,4-Dimethylaniline) |
6.7 |
121.18 |
122.06 |
107.10 |
23 |
77.00 |
39 |
|||||
105.10 |
23 |
※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함
7) 정성시험
가) 정성
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율(%) |
허용범위 |
> 50 % |
≤ 20 % |
> 20 %, ≤ 50 % |
≤ 25 % |
> 10 %, ≤ 20 % |
≤ 30 % |
나) 표준품 크로마토그램
|