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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.100 아미트라즈(Amitraz)
  • 8.3.100 아미트라즈(Amitraz)

    1) 시험법 적용범위

    축산물(벌꿀 제외) 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    검체 중 분석대상물질을 아세토니트릴, 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨 또는 헥산, 이소프로필알코올, 수산화나트륨으로 추출하여 C18으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액 : 100 mL 용량플라스크에 아미트라즈, 2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline, 아미트라즈대사체)표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

    라) 혼합표준용액 : 100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

    마) 10 mM 개미산암모늄(ammonium formate) 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    바) 0.1% 개미산(formic acid) 함유 메탄올 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

    사) 0.1 M 수산화나트륨용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 수산화나트륨(NaOH) 4.04 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.

    아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용

    가) 가금육

    균질화한 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL을 가한 후 1분간 진탕한다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 가한 뒤 1분간 진탕하고 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 새로운 15 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 40°C 수용액상에서 질소농축한 후 아세토니트릴 1 mL를 가하여 재분산한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하고 0.2 µm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 후 시험용액으로 한다.

    나) 가금육을 제외한 식육

    미리 균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 균질화된 알(아미트라즈 및 2,4-디메틸아닐린이 검출되지 않은 알이어야 함) 2 mL, 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 15 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 40°C에서 질소농축하고, 잔류물을 아세토니트릴 0.5 mL로 재분산하여 1분간 진탕한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

    다) 알

    균질화한 검체 2 g을 15 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1 M 수산화나트륨용액 2 mL, 헥산 4 mL, 이소프로필알코올 1.2 mL을 가한 뒤 1분간 진탕한 후 4℃에서 2,700G로 5분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 40°C 수용액상에서 질소농축한 후 아세토니트릴 1 mL를 가하여 재분산한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리하여 상층액을 취하고 0.2 µm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 후 시험용액으로 한다.

    라) 유

    균질화한 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL을 가한 후 1분간 진탕한다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 가한 뒤 1분간 진탕한 것을 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 150 mg PSA, 150 mg C18, 900 mg MgSO4를 담겨진 새로운 15 mL 원심분리관에 넣은 후 1분간 진탕하고, 4℃에서 2,700G로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 40℃ 수용액상에서 질소농축한 후 아세토니트릴 1 mL를 가하여 재분산한다. 이를 5분간 초음파처리한 후, 4℃에서 13,500G로 3분간 원심분리한다. 상층액을 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1) 칼럼: C18(Phenomenex Luna, 2.0 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A : 10 mM 개미산암모늄 용액

    (나) 이동상 B : 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    90

    10

    3

    0

    100

    9

    0

    100

    10

    90

    10

    15

    90

    10

    (3) 유속: 0.25 mL/분

    (4) 칼럼온도: 40℃

    (5) 주입량: 10 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionization: ESI (Positive)

    (2) Gas Temperature: 350℃

    (3) Collision gas: N2(질소)

    (4) 분석대상물질의 개별 조건

    연번

    물질명

    (Compound)

    머무름 시간(분)

    분자량

    (MW)

    선구이온

    (Precursor

    ion, m/z)

    생성이온

    (Product

    ion, m/z)

    충돌에너지

    (Collision Energy, eV)

    1

    아미트라즈

    (Amitraz)

    9.2

    293.41

    294.13

    163.20

    19

    122.10

    43

    107.10

    59

    2

    2,4-디메틸아닐린

    (2,4-Dimethylaniline)

    6.7

    121.18

    122.06

    107.10

    23

    77.00

    39

    105.10

    23

    ※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    ※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

    7) 정성시험

    가) 정성

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

    주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율(%)

    허용범위

    > 50 %

    ≤ 20 %

    > 20 %, ≤ 50 %

    ≤ 25 %

    > 10 %, ≤ 20 %

    ≤ 30 %

    나) 표준품 크로마토그램