8.3.106 디클로페낙(Diclofenac), 메토서페이트(Metoserpate), 부퀴놀레이트 (Buquinolate)
1) 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.
2) 분석원리
검체 중의 분석대상물질을 개미산암모늄이 함유된 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액 : 100 mL 용량플라스크에 각 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.
라) 혼합표준용액 : 100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 하여 사용한다.
마) 0.1% 아세트산(Acetic acid) 용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
바) 0.1% 개미산(Formic acid)을 함유한 아세토니트릴 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.
바) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용액의 조제
균질화된 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴을 10 mL을 가하여 10분간 진탕 혼합한 후 4℃에서 2,600G로 15분간 원심 분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 10 mL을 넣고 10분간 진탕 혼합한 후 4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 담아 40℃ 수용액상에서 0.3 mL가 될 때까지 질소농축한 후 0.1% 아세트산용액:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 1.7 mL을 가하여 재분산한다. 4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리 한 후 상층액을 0.45 μm 막 여과지(PTFE membrane filter)로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 칼럼:C18(Phenomenex Luna 2.0 × 100 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A : 0.1% 아세트산 용액
(나) 이동상 B : 메탄올
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0 |
90 |
10 |
3 |
90 |
10 |
5 |
10 |
90 |
13 |
10 |
90 |
15 |
90 |
10 |
20 |
90 |
10 |
(3) 유속 : 0.25 mL/분
(4) 칼럼온도 : 30℃
(5) 주입량 : 10 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization : ESI(positive, negative)
(2) Capillary Temperature : 350℃
(3) Collision gas : N2(질소)
(4) 분석대상물질의 개별 조건(MRM 조건)
연번 |
물질명 (Compound) |
이온화 (Ionization mode) |
머무름 시간(분) |
분자량 (MW) |
선구이온 (Precusor ion, m/z) |
생성이온 (Product ion, m/z) |
충돌에너지 (Collision Energy,eV) |
1 |
디클로페낙 (Diclofenac) |
Negative |
12.58 |
296.1 |
293.7 |
250.0 |
-12 |
214.0 |
-28 |
||||||
178.0 |
-38 |
||||||
2 |
메토서페이트 (Metoserpate) |
Positive |
9.03 |
428.5 |
429.1 |
174.1 |
41 |
131.1 |
89 |
||||||
130.0 |
119 |
||||||
3 |
부퀴놀레이트 (Buquinolate) |
Positive |
12.19 |
361 |
362.1 |
204.0 |
49 |
316.2 |
23 |
||||||
148.1 |
65 |
※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함
7) 정성시험
가) 정성
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(response ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
주1). 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율(%) |
허용범위 |
> 50 % |
≤ 20 % |
> 20 %, ≤ 50 % |
≤ 25 % |
> 10 %, ≤ 20 % |
≤ 30 % |
나) 표준품 크로마토그램
|