8.3.109 독시싸이클린(Doxycycline), 린코마이신(Lincomycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 에리스로마이신(Erythromycin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline), 클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline), 타일로신(Tylosin), 테트라싸이클린(Tetracycline), 트리메토프림(Trimethoprim)
1) 시험법 적용범위
벌꿀, 로얄젤리 등에 적용한다.
2) 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 EDTA-NA2와 구연산이 함유된 물로 추출하고 HLB 카트리지를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액 : 각 표준품(타일로신의 경우 타일로신 A 표준품을 사용한다)을 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올 (엔로플록사신, 시프로플록사신은 0.2% 개미산을 함유한 메탄올)에 녹여 100 mg/L이 되게 한다.
라) 혼합표준용액 : 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.
마) 0.1% 개미산(formic acid)을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산(formic acid) 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
바) 0.5 M EDTA-Na2(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)을 함유한 물 : 500 mL 용량플라스크에 EDTA-Na2dihydrate 93.1 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
사) 0.1 M 구연산(citric acid)을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 구연산 19.2 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
아) 추출용액 : 0.5 M EDTA-Na2을 함유한 물과 0.1 M 구연산(citric acid)을 함유한 물을 2 : 8(v/v)로 혼합한다.
자) 0.04% 암모니아수를 함유한 메탄올 : 1,000 mL 용량플라스크에 암모니아 수용액(28%) 0.4 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
차)HLB 카트리지(Hydrophilic Lipophilic Balance Cartridge): Divinylbenzene–N-vinylpyrrolidone Copolymer (500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것
카) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것
5) 시험용액의 조제
가) 아카시아꿀, 잡화꿀, 밤꿀
균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 10 mL를 가하여 10분간 진탕한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 상층액을 0.45 μm 막여과지(PVDF membrane filter)로 여과하여 15 mL 원심분리관에서 담는다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화 시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 2회 세척한다. 새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04% 암모니아수를 함유한 메탄올 3 mL로 용출한 후, 45℃ 이하의 수욕 중에서 질소농축 한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로 재용해하여 5분간 진탕한 후 4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
나) 마누카꿀, 로얄젤리
균질화된 검체 1 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 7 mL를 가하여 10분간 진탕 혼합한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 상층액을 새로운 원심분리관에 담고 추출용액 8 mL를 가하여 10분간 진탕 혼합한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 0.45 μm 막여과지(PVDF membrane filter)로 여과하여 15 mL 원심분리관에서 담는다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화 시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 3회 세척한다. 새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04% 암모니아수를 함유한 메탄올 3 mL로 용출한 후, 45℃ 이하의 수욕 중에서 질소농축 한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로 재분산하여 5분간 진탕한 후 4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1) 칼럼:C18(Phenomenex Kinetex EVO, 2.1 × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A : 0.1% 개미산을 함유한 물
(나) 이동상 B : 아세토니트릴
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0 |
30 |
70 |
10 |
30 |
70 |
(3) 유속 : 0.2 mL/분
(4) 칼럼온도 : 30℃
(5) 주입량 : 2 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization : ESI(positive)
(2) Capillary Temperature : 350℃
(3) Collision gas : N2(질소)
(4) 분석대상물질의 개별 조건
연번 |
물질명 (Compounds) |
머무름 시간(분) |
분자량 (MW) |
선구이온(Precursor ion, m/z) |
생성이온(Product ionm/z) |
충돌에너지(Collision Energy, eV) |
1 |
독시사이클린 (doxycycline) |
1.31 |
444.4 |
445.27 |
428 |
21 |
98 |
61 |
|||||
267 |
51 |
|||||
2 |
린코마이신 (lincomycin) |
1.26 |
406.5 |
407.29 |
126 |
37 |
359 |
21 |
|||||
125 |
73 |
|||||
3 |
시프로플록사신 (ciprofloxacin) |
1.28 |
331.4 |
332.18 |
314 |
23 |
231 |
47 |
|||||
288 |
19 |
|||||
4 |
에리스로마이신 (erythromycin) |
1.29 |
733.9 |
734.49 |
158 |
43 |
83 |
73 |
|||||
116 |
61 |
|||||
5 |
엔로플록사신 (enrofloxacin) |
1.29 |
359.4 |
360.20 |
316 |
23 |
245 |
37 |
|||||
342 |
25 |
|||||
6 |
옥시테트라사이클린 (oxytetracycline) |
1.33 |
460.4 |
461.25 |
426 |
23 |
201 |
51 |
|||||
127 |
97 |
|||||
7 |
클로르테트라사이클린 (chlortetracycline) |
1.34 |
478.9 |
479.26 |
444 |
23 |
154 |
35 |
|||||
462 |
21 |
|||||
8 |
타일로신 A (tylosin A) |
1.29 |
916.1 |
916.54 |
174 |
47 |
101 |
65 |
|||||
116 |
75 |
|||||
9 |
테트라사이클린 (tetracycline) |
1.33 |
444.4 |
445.27 |
410 |
23 |
154 |
33 |
|||||
98 |
53 |
|||||
10 |
트리메토프림 (trimethoprim) |
1.28 |
290.3 |
291.244 |
123 |
31 |
230 |
23 |
|||||
261 |
35 |
※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함
7) 정성시험
가) 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(response ratio)을 비교하여 그 비율이 ± 20~30 % 이내에서 일치하여야 한다. ※주1 참조
주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율(%) |
허용범위 |
> 50 % |
± 20 % |
> 20 %, ≤ 50 % |
± 25 % |
> 10 %, ≤ 20 % |
± 30 % |
나) 표준품 크로마토그램
|
독시싸이클린 (doxycycline) |
|
린코마이신 (lincomycin) |
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시프로플록사신 (ciprofloxacin) |
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