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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.109 독시싸이클린(Doxycycline), 린코마이신(Lincomycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 에리스로마이신(Erythromycin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline), 클로르테트라싸
  • 8.3.109 독시싸이클린(Doxycycline), 린코마이신(Lincomycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 에리스로마이신(Erythromycin), 엔로플록사신(enrofloxacin), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline), 클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline), 타일로신(Tylosin), 테트라싸이클린(Tetracycline), 트리메토프림(Trimethoprim)

    1) 시험법 적용범위

    벌꿀, 로얄젤리 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    시료 중의 분석대상물질을 EDTA-NA2와 구연산이 함유된 물로 추출하고 HLB 카트리지를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액 : 각 표준품(타일로신의 경우 타일로신 A 표준품을 사용한다)을 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올 (엔로플록사신, 시프로플록사신은 0.2% 개미산을 함유한 메탄올)에 녹여 100 mg/L이 되게 한다.

    라) 혼합표준용액 : 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

    마) 0.1% 개미산(formic acid)을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산(formic acid) 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    바) 0.5 M EDTA-Na2(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)을 함유한 물 : 500 mL 용량플라스크에 EDTA-Na2dihydrate 93.1 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    사) 0.1 M 구연산(citric acid)을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 구연산 19.2 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    아) 추출용액 : 0.5 M EDTA-Na2을 함유한 물과 0.1 M 구연산(citric acid)을 함유한 물을 2 : 8(v/v)로 혼합한다.

    자) 0.04% 암모니아수를 함유한 메탄올 : 1,000 mL 용량플라스크에 암모니아 수용액(28%) 0.4 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

    차)HLB 카트리지(Hydrophilic Lipophilic Balance Cartridge): Divinylbenzene–N-vinylpyrrolidone Copolymer (500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

    카) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 시험용액의 조제

    가) 아카시아꿀, 잡화꿀, 밤꿀

    균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 10 mL를 가하여 10분간 진탕한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 상층액을 0.45 μm 막여과지(PVDF membrane filter)로 여과하여 15 mL 원심분리관에서 담는다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화 시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 2회 세척한다. 새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04% 암모니아수를 함유한 메탄올 3 mL로 용출한 후, 45℃ 이하의 수욕 중에서 질소농축 한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로 재용해하여 5분간 진탕한 후 4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

    나) 마누카꿀, 로얄젤리

    균질화된 검체 1 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 7 mL를 가하여 10분간 진탕 혼합한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 상층액을 새로운 원심분리관에 담고 추출용액 8 mL를 가하여 10분간 진탕 혼합한 후 4℃, 2,600G에서 15분간 원심 분리한다. 0.45 μm 막여과지(PVDF membrane filter)로 여과하여 15 mL 원심분리관에서 담는다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화 시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 3회 세척한다. 새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04% 암모니아수를 함유한 메탄올 3 mL로 용출한 후, 45℃ 이하의 수욕 중에서 질소농축 한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로 재분산하여 5분간 진탕한 후 4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm 막여과지(PTFE membrane filter)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

    6) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1) 칼럼:C18(Phenomenex Kinetex EVO, 2.1 × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2) 이동상

    (가) 이동상 A : 0.1% 개미산을 함유한 물

    (나) 이동상 B : 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    30

    70

    10

    30

    70

    (3) 유속 : 0.2 mL/분

    (4) 칼럼온도 : 30℃

    (5) 주입량 : 2 μL

    나) 질량분석기 조건

    (1) Ionization : ESI(positive)

    (2) Capillary Temperature : 350℃

    (3) Collision gas : N2(질소)

    (4) 분석대상물질의 개별 조건

    연번

    물질명

    (Compounds)

    머무름

    시간(분)

    분자량

    (MW)

    선구이온(Precursor ion, m/z)

    생성이온(Product ionm/z)

    충돌에너지(Collision Energy, eV)

    1

    독시사이클린

    (doxycycline)

    1.31

    444.4

    445.27

    428

    21

    98

    61

    267

    51

    2

    린코마이신

    (lincomycin)

    1.26

    406.5

    407.29

    126

    37

    359

    21

    125

    73

    3

    시프로플록사신

    (ciprofloxacin)

    1.28

    331.4

    332.18

    314

    23

    231

    47

    288

    19

    4

    에리스로마이신

    (erythromycin)

    1.29

    733.9

    734.49

    158

    43

    83

    73

    116

    61

    5

    엔로플록사신

    (enrofloxacin)

    1.29

    359.4

    360.20

    316

    23

    245

    37

    342

    25

    6

    옥시테트라사이클린

    (oxytetracycline)

    1.33

    460.4

    461.25

    426

    23

    201

    51

    127

    97

    7

    클로르테트라사이클린

    (chlortetracycline)

    1.34

    478.9

    479.26

    444

    23

    154

    35

    462

    21

    8

    타일로신 A

    (tylosin A)

    1.29

    916.1

    916.54

    174

    47

    101

    65

    116

    75

    9

    테트라사이클린

    (tetracycline)

    1.33

    444.4

    445.27

    410

    23

    154

    33

    98

    53

    10

    트리메토프림

    (trimethoprim)

    1.28

    290.3

    291.244

    123

    31

    230

    23

    261

    35

    ※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    ※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

    7) 정성시험

    가) 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(response ratio)을 비교하여 그 비율이 ± 20~30 % 이내에서 일치하여야 한다. ※주1 참조

    주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율(%)

    허용범위

    > 50 %

    ± 20 %

    > 20 %, ≤ 50 %

    ± 25 %

    > 10 %, ≤ 20 %

    ± 30 %

    나) 표준품 크로마토그램

    독시싸이클린 (doxycycline)

    린코마이신 (lincomycin)

    시프로플록사신 (ciprofloxacin)