9.2.9 아플라톡신(B1, B2, G1, G2), 오크라톡신 A, 제랄레논, 푸모니신(B1, B2) 동시분석법

가. 시험법 적용범위

식물성 원료 및 그 가공식품(아플라톡신은 식물성원료 및 모든 가공식품)

나. 분석원리

검체 중 곰팡이독소를 0.1% 개미산을 함유한 50% 아세토니트릴용액으로 추출한 후 정제 카트리지를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1)액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

2)정제용 카트리지 : 곰팡이독소 다성분 분석용 SPE

3) 유리섬유여과지 : GF/A (pore size : 1.6 ㎛)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 추출용액 : 0.1% 개미산을 함유한 50% 아세토니트릴 용액

4) 표준원액 :
아플라톡신 B 1, 아플라톡신 B 2, 아플라톡신 G 1, 아플라톡신 G 2, 푸모니신 B 1, 푸모니신 B 2의 표준품 각각은 메탄올로 오크라톡신 A, 제랄레논의 표준품 각각은 아세토니트릴에 용해하여 1,000 μg/mL 가 되게 한다.

5) 혼합표준용액 : 각각의 표준원액을
0.1% 개미산을 함유한 50% 메탄올 용액을 사용하여 아플라톡신 B1은 0.05 μg/mL, 아플라톡신 B2는 0.125 μg/mL, 아플라톡신 G1, G2는 0.5 μg/mL, 오크라톡신 A는 0.25 μg/mL,제랄레논은 1 μg/mL, 푸모니신 B1은 5 μg/mL, 푸모니신 B2는 10 μg/mL로 조제한 후 실험 시 적당한 농도로 희석하여 검량선을 작성한다.

6) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

가) 우유류, 발효유를 제외한 식품

1) 추출

검체를 분쇄하여 균질화한 후 2∼5 g을 정밀히 달아 추출용액(V1) 20 mL(액상시료의 경우 최종 20 mL가 되도록 함)를 가하고, 30분간 추출한 후 3,700
G에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 액을 유리섬유여과지로 여과한 후 여액(V 2) 3 mL에 물을 가해 15 mL(V 3)가 되게 하여 추출액으로 한다.

2) 정제

초당 1방울의 속도로 정제 카트리지를 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 활성화시킨 후 추출액(V4) 5 mL를 주입하여 통과시킨다. 이어서 물 2 mL, 10% 아세토니트릴 용액 2 mL를 같은 유속으로 통과시킨 후 정제 카트리지 내에 남아 있는 용액을 완전히 제거한다. 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴 용액 2 mL, 메탄올 4 mL로 용출시킨 후 50℃에서 질소로 건고시킨다. 건고물에 0.1% 개미산을 함유한 50% 메탄올 용액 0.5∼1 mL(V
5)를 가하여 용해시킨 후 필터(PTFE, 0.2 ㎛)로 여과한 액을 최종 시험용액으로 한다.

나) 우유류, 발효유

검체를 균질화한 후 5 g을 정밀히 달아 추출용액(V1) 20 mL(액상시료의 경우 최종 20 mL가 되도록 함)를 가한다. 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL을 가한 후 10분간 진탕하고 3,700
G에서 10분간 원심분리한다. 상층액(헥산층)을 제거하고 섬유여과지로 여과한 후 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 액을 최종 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1)액체크로마토그래프 분석조건

가) 칼럼 : C18(3 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 칼럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 5 mM 개미산암모늄 용액(0.1% 개미산 포함)

(2) 이동상 B : 5 mM 개미산암모늄 메탄올 용액(0.1% 개미산 포함)

(3) 농도 구배 조건

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
0.5	95	5
2	60	40
9	0	100
11.5	0	100
12	95	5
15	95	5

라) 유속 : 0.5 mL/min

마) 주입량 : 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가)Ionization: ESI Positive, Negative mode

나) Curtain gas : 30

다) Collision gas : 9

라) Ion spray voltage : 4,500

마)Ion source temperature : 500℃

바) Ion source gas 1 : 50

사) Ion source gas 2 : 50

아) Collision gas : N2

표 1. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온(Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, V)
아플라톡신 B1	Positve	312.27	312.97	285.1	35
				240.9	51
아플라톡신 B2	Positve	314.29	314.97	287.0	37
				258.8	41
아플라톡신 G1	Positve	328.27	328.96	199.9	45
				243.1	55
아플라톡신 G2	Positve	330.29	331.10	189.1	57
				245.1	57
오크라톡신 A	Positve	403.81	403.97	238.9	35
				102.0	95
푸모니신 B1	Positve	721.83	722.27	334.1	55
				352.2	51
푸모니신 B2	Positve	705.83	706.25	336.2	46
				318.2	46
제랄레논	Negative	318.36	317.02	174.9	-34
				131.0	-38

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며, 그 외는 정성이온임.

※ 액체크로마토그래프 분석조건 및 각 생성이온에 대한 질량분석기의 분석조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함.

3) 표준용액 크로마토그램

Ⓐ: 아플라톡신 B1312.97/285.1