9.2.6 오크라톡신 A(Ochratoxin A)

가. 시험법의 적용범위 : 곡류, 메주, 커피류, 고춧가루, 포도주스, 포도주스농축액, 포도주, 건포도

나. 분석원리검체 중의 오크라톡신 A를 추출용매로 추출, 여과한 것을 면역친화성칼럼으로 정제시키고 액체크로마토그래프로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

2) 정제용 칼럼: 오크라톡신용 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column) (회
수율 및 재현성 등이 검증된 것)

3) 페닐실란고상추출칼럼(Phenyl silane solid phase extract column) : BakerBond SPE Phenyl(500 mg) 또는 이와 동등한 것

4) 여과지：Whatman No.4(12.0 cm) 또는 이와 동등한 것

5) 유리섬유여과지(glass fiber filter) : Whatman GF/A(pore size : 1.6 μm) 또는 이와 동등한 것

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 오크라톡신 A 표준원액
오크라톡신 A를 톨루엔․초산(99:1, v/v) 혼합용액에 녹여 200 μg/mL가 되도록 한다.

4) 오크라톡신 A 표준용액
오크라톡신 A 표준원액 100 μL를 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 아세토니트릴․물․초산(99:99:2, v/v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 후, 이를 아세토니트릴․물․초산(99:99:2, v/v/v) 혼합용액으로 0.1～50 ng/mL의 농도가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

5) PBS(Phosphate-buffered saline) 용액
염화나트륨(NaCl) 8.0 g, 무수 제이인산나트륨(Na 2HPO4) 1.16 g, 제일인산칼륨 (KH 2PO4) 0.2 g 및 염화칼륨(KCl) 0.2 g을 물 990 mL에 녹인 것을 0.2 M 수산화나트륨으로 pH 7.4로 조정한 후 물로 1 L로 한다.

6) 3% 탄산수소나트륨 용액
탄산수소나트륨(NaHCO 3) 30 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

7) 추출용액 I

아세토니트릴․물(60:40, v/v) 혼합용액

8) 추출용액 II

메탄올․3% 탄산수소나트륨(50:50, v/v) 혼합용액

9) 0.01% 트윈 20 함유 PBS 용액
트윈 20(Tween 20) 0.01 mL를 취하여 PBS 용액으로 100 mL한 것을 사용한다.

10) 5% 탄산수소나트륨(NaHCO
3) 함유 1% PEG(Polyethylene glycol) 용액

10 g의 PEG 8000 (Polyethylene glycol)과 50 g의 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 물 950 mL에 녹이고 pH를 8.3으로 맞춘 후 1 L로 한다.

11)1 M PBS (Phosphate-buffered saline) 용액

제이인산나트륨(Na2HPO4·2H2O) 2.56 g, 제일인산나트륨(Na2HPO4·H2O) 12.6 g과 염화나트륨(NaCl) 87.9 g을 물 950 mL에 녹인 것을 pH 7.4로 조정한 후 1 L로 한다.

12)0.1 M PBS (Phosphate-buffered saline) 용액

1 M PBS(Phosphate-buffered saline) 용액을 물로 10배 희석하여 사용한다.

13) 1% 탄산수소나트륨 용액
탄산수소나트륨(NaHCO 3) 10 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

마. 시험용액의 조제

1) 곡류 및 메주

가) 추출검체를 분쇄하여 균질화한 시료 25 g을 정밀히 달아 추출용액 I 100 mL를 넣어 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 5 mL를 100 mL 플라스크에 취하고 PBS 용액 55 mL로 희석시킨다. 희석액을 흔들어 섞은 후 유리섬유여과지(glass fiber filter)로 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제추출액 48 mL(검체 1g에 해당)를 정제용 컬럼에 주입하여 초당 1～2 방울의 속도로 통과시킨다.이어서 물 10 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 메탄올 1 mL로 용출시킨다. 용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 아세토니트릴․물․초산(99:99:2, v/v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 후 시린지 필터(pore size : 0.2 μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

2) 커피류 및 고춧가루

가) 추출검체를 분쇄하여 균질화한 시료 5 g을 정밀히 달아 추출용액 II 100 mL를 넣어 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 6 mL를 50 mL 플라스크에 취하고 3% 탄산수소나트륨 용액 18 mL를 가하여 희석시킨다. 이 중 20 mL을 취하여 추출액으로 한다.

나) 정제미리 메탄올 15 mL와 3% 탄산수소나트륨 용액 5 mL을 차례로 흘려 활성화 시킨 페닐실란고상추출칼럼에 위의 추출액 20 mL를 일회용 주사기를 이용하여 주입하고 메탄올․3% 탄산수소나트륨(25:75, v/v) 10 mL와 3% 탄산수소나트륨 용액 5 mL을 차례로 주입하여 칼럼을 세척한 후 7% 메탄올용액 10 mL로 용출시킨다. 용출액을 50 mL 정용플라스크에 넣고 PBS 용액으로 50 mL로 한다. 이를 면역친화성칼럼에 주입하여 초당 1～2 방울의 속도로 통과시킨다. 이어서 0.01% 트윈 20 함유 PBS 용액 10 mL와 증류수 10 mL를 차례로 흘려 칼럼을 세척하고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 메탄올 2 mL로 용출시킨다.용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 아세토니트릴․물․초산(99:99:2, v/v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 후 시린지 필터(pore size : 0.2 μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

3) 포도주스, 포도주스농축액 및 포도주

가) 추출검체 10.0 g에 5% 탄산수소나트륨(NaHCO3) 함유 1% PEG(Polyethylene glycol) 용액을 가하여 20 mL이 되게 한 후 5분간 고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과하여 추출액으로 한다.

나) 정제추출액 10 mL를 면역친화성칼럼에 주입하고 2.5% 염화나트륨 0.5% 탄산수소나트륨 용액(25 g의 염화나트륨과 5 g의 탄산수소나트륨을 950 mL의 물에 녹이고 pH를 8.1로 맞춘 후 1 L로 한다.) 5 mL과 물 5 mL를 차례로 흘려 세척하고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 메탄올 2 mL로 용출시킨다. 용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 아세토니트릴․물․초산(99:99:2, v/v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 후 시린지 필터(pore size : 0.2 μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4) 건포도

가) 추출검체 25 g을 정밀히 달아 1% 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액 60 mL을 넣어 1분간 고속으로 균질화한 후 메탄올 140 mL을 가하고 1시간 동안 진탕한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 10 mL를 40 mL의 0.1 M PBS 용액으로 희석한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제추출액 40 mL를 면역친화성칼럼에 주입하고 물 5 mL를 흘려 세척하고 칼럼 내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 메탄올 2.5 mL로 용출시킨다. 용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 아세토니트릴․물․초산(99:99:2, v/v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 후 시린지 필터(pore size : 0.2μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 기기 측정조건

가) 칼럼 : C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 아세토니트릴․물․초산(99:99:2, v/v/v) 혼합용액

다) 칼럼온도 : 35℃

라) 검출파장

(1) 여기파장 : 333 nm

(2) 형광파장 : 460 nm

마) 유속 : 1 mL/분

바) 주입량 : 5～20 μL

2) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램