9.16 우루시올

가. 시험법의 적용범위

옻나무를 원료로 사용한 식품에 적용한다.

나. 분석원리

식품 내에 존재하는 우루시올을 아세토니트릴로 추출한 후 dSPE(dispersive SPE)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 우루시올 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 μg/mL가 되게 한 다음 -70°C에서 차광 보관한다.

4)혼합표준용액 : 각 표준원액을 메탄올에
적당한농도로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다. 조제한 용액은 물질의 안정성 문제로 -70°C에서 30일 동안 차광 보관 및 사용한다.

표1. 우루시올 표준품 정보

성분명	CAS No.	분자식	화학구조
우루시올 Ⅰ (C15:0)	492-89-7	C21H36O2
우루시올 Ⅱ (C15:1)	35237-02-6	C21H34O2
우루시올 Ⅲ (C15:2)	83258-37-1	C21H32O2
우루시올 Ⅴ (C15:3)	83543-37-7	C21H30O2
라콜 (C17:0)	5862-27-1	C23H40O2

5)추출용액(50 mM 아세트산 암모늄(ammonium acetate) 버퍼 (pH 4.1) + 0.1 M EDTA) :
500 mL 용량플라스크에 아세트산 암모늄 1,927 mg을 적당량의 물에 녹여 표시선을 맞추고(정용하고) pH가 4 정도 되는지 확인한다. 여기에 EDTA 14.6 g을 넣고 충분히 녹을 때까지 1시간 초음파 처리한다. EDTA가 완전히 녹지 않으므로 상온에서 보관하며 상층액만 사용하고, 필요하다면 원심분리 후 사용한다.

6) 정제용 시약(
dSPE 카트리지) : QuEChERS 정제용 또는 이와 동등한 것

가) 물추출물 등 액상검체 :PSA(Primary secondary amine):C18:황산마그네슘이 1:1:6의 비율(6.25mg:6.25mg:37.5 mg)로 혼합된 시약

나) 장류 등 고상검체 :PSA:황산마그네슘이 1:6(50 mg:300 mg)의 비율로 혼합된 시약

7)0.1% 개미산(Formic acid) 용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다(정용한다).

8) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

1) 추출

균질화된 시료 2g(된장의 경우 1g)을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 추출용액 5 mL를 가한 후 교반기(vortex mixer)로 1분간 혼합한다. 아세토니트릴 5 mL과 염화나트륨 1 g을 가하고, 교반기로 1분간 추출한 다음, 4℃, 2,700 G에서 10분간 원심분리한다.

2) 정제

15 mL 원심분리관에 정제용 시약(dSPE 카트리지)50mg(액상검체) 또는 350 mg(고상검체)을 취하고 분리된 상층액 전량을 넣는다.교반기로 1분간 혼합하고, 4℃, 2,700 G에서 10분간 원심분리한 뒤, 상층액 전량을 새로운 15 mL 원심분리관에 옮긴다. 40°C 수용액상에서 질소건고한 후 , 메탄올 1 mL를 가하고 교반기로 1분간 혼합한 후 5분간 초음파 처리하여 용해시킨다. 이 액을 4℃, 13,500 G에서 3분간 원심분리한 후, 상층액을 최종 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 측정조건

가) 칼럼 :C18 (2.0 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 칼럼온도 : 40°C

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% 개미산 용액

(2) 이동상 B : 메탄올

(3) 농도 구배 조건

시간(분)	이동상A(%)	이동상B(%)
0.0	20	80
1.0	20	80
3.0	0	100
10.0	0	100
10.5	20	80
15	20	80

라) 유속: 0.25 mL/min

마) 주입량 : 10 μL

2) 질량분석기 측정조건

가) Ionization : ESI negative-ion mode

나) Ion source temperature : 350℃

다) Ion spray voltage: -4.5 kV

라) Curtain gas : 6 psi

마) Collision gas(N2) : 10 psi

바) Ion source gas 1 : 10 psi

사) Ion source gas 2 : 20 psi

표2. 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 MRM 조건

연번	성분명 (Compound)	머무름시간 (분)	분자량 (g/mol)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision Energy, eV)
1	Urushiol Ⅰ	8.98	320.5	319.1	122.2 136.1	-48 -46
2	Urushiol Ⅱ	8.41	318.5	317.1	122.0 135.0	-42 -56
3	Urushiol Ⅲ	8.00	316.5	315.3	122.0 135.2	-44 -50
4	Urushiol Ⅴ	7.65	314.5	313.3	135.1 122.0	-48 -44
5	Laccol	9.82	348.6	347.4	121.9 135.0	-52 -60

※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※각 생성이온(Production)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의최적값으로 변경하여사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

3) 검량선 작성

우루시올의 특성(산화반응에 따른 폴리머 형성 등)을 고려하여 다음의 Matrix- matched standard(MMS) 조제법에 따라 처리한혼합표준용액을 농도별로 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 주입한다. 얻어진크로마토그램 상의정량이온의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선(Matrix-matched calibration curve)을 작성한다.

가) Matrix-matched standard(MMS) 조제법

음성검체(Blank sample)2g(된장의 경우 1g)을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 추출용액 5 mL를 가한 후 교반기(vortex mixer)로 1분간 혼합한다. 아세토니트릴 5 mL와 염화나트륨 1 g을 첨가하고, 교반기로 1분간 추출한 다음, 4℃, 2,700 G에서 10분간 원심분리한다.15 mL 원심분리관에 정제용 시약(dSPE 카트리지)50mg(액상검체) 또는 350 mg(고상검체)을 취하고 분리된 상층액 전량을 넣는다.교반기로 1분간 혼합하고, 4℃, 2,700 G에서 10분간 원심분리한 뒤, 상층액 전량을 새로운 15 mL 원심분리관에 옮긴다. 각 검량선 농도[표 3]에 맞는 혼합표준용액 0.2 mL(된장의 경우 0.1mL)을가하고,40°C 수용액상에서 질소건고한다. 메탄올 1 mL을 가하고 교반기로 1분간 혼합한 후 5분간 초음파 처리하여 용해시킨다. 이 액을 4℃, 13,500 G에서 3분간 원심분리한 후, 상층액을 최종 표준용액으로 한다.

표3. Matrix-matched standard 조제에 사용한 표준용액 농도 및 부피

검량선 농도	혼합표준용액 농도	첨가 부피
10 ng/mL	100 ng/mL	0.2 mL (된장의 경우 0.1mL)
20 ng/mL	200 ng/mL
30 ng/mL	300 ng/mL
40 ng/mL	400 ng/mL
50 ng/mL	500 ng/mL

4) 혼합표준용액의 크로마토그램