9.18 포몹신 A(Phomopsin A) 시험법

가. 시험법의 적용범위

루핀콩 및 루핀 가공품에 적용한다.

나. 분석원리

검체 중 분석대상물질을 아세토니트릴/정제수/초산(80:19:1, v/v/v)용액으로 추출하고 원심분리 한 후 상층액을 증류수로 희석한 다음 막여과지로 여과한 여액을 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

다. 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매：액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 :
용량플라스크에 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 500 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4)표준용액 :
표준원액을 메탄올에 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

5) 추출
용액 :아세토니트릴 80 mL, 증류수 19 mL, 초산 1 mL을 넣고 혼합하여 추출 용액으로 사용한다.

6) 5mM 개미산암모늄 용액 :
1,000 mL 용량플라스크에 개미산암모늄 315.3 mg을 넣고 정제수로 표시선까지 채운다.

7) 5mM 개미산암모늄 95% 메탄올 용액 : 개미산
암모늄 315.3 mg을 넣고 메탄올 950 mL, 정제수 50 mL을 혼합하여 사용한다.

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액(아세토니트릴/증류수/초산(80:19:1, v/v/v)) 20 mL을 가하여 60분간 진탕한 후, 상온에서 3,500G로 10분간 원심분리하여 상층액을 취한 후 증류수와 1:1(v/v) 비율로 희석한다. 막여과지(PTFE filter 0.2μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 칼럼 : C18(Atlantis T3, 3 mm ｘ 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A :
5mM 개미산암모늄용액

(2) 이동상 B :
5mM 개미산암모늄 95% 메탄올용액

(3) 농도 구배 조건

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	90	10
1	90	10
9	0	100
11	0	100
11.1	90	10
15	90	10

다) 유속 : 0.4 mL/min

라) 칼럼온도 : 35℃

마) 주입량 : 10 μL

2) 질량분석기 조건

가) Ionization : ESI (Positive)

나) Collision gas : N2(질소)

다) 분석대상 및 개별 조건(MRM 조건)

분석성분 (Compound)	분자량 (M.W.)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
포몹신 A (Phomopsin A)	789.236	789.2	323.1	35
			226.1	47

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온은 정성이온임

※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

3) 표준품 크로마토그램