4.24 브루셀라(Brucella spp.)

가. 배양 및 균 분리
검체 25 g 또는 25 mL을 amphotericin B 1 ㎍/mL, vancomycin 20 ㎍/mL가 첨가된 serum dextrose 배지(배지 82), TSB 배지(배지 23) 또는 Brucella 배지(배지 85) 225 mL에 넣은 후 균질화 한 다음 5～10%의 CO2 가스 주입이 되는 37℃ 배양기에서 6주 동안 배양하면서 주마다 배지에 도말하여 확인한다. 검체를 가하지 아니한 증균배지를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 다만, 검체가 심하게 오염되었거나 브루셀라균이 매우 낮은 농도로 오염되었을 가능성이 클 경우에 동물실험을 할 수 있다.

나. 동물실험

우유의 경우는 25 mL를 3,000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 유지부와 침전물을 직접도말 배양하고 두 마리 이상의 guinea pig(250～300 g 체중)에 3～5 mL씩을 피하 또는 찰과상을 입은 피부에, 세 마리 이상의 마우스(12～15 g)의 정맥 또는 복강 내에 0.25～0.5 mL씩을 주사한다.

고체시료는 시료 25 g에 희석액 225 mL를 가한 후 유제액을 조제하여 직접도말 배양하고 또한 유제액을 멸균가아제로 여과한 후 그 여액 또는 1,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 실험동물에 접종한다. 실험동물 접종 3주 후에 채취한 혈청에 대해 브루셀라 항체가 형성되었는지 여부를 검사하고 비장에서 브루셀라균을 분리배양 한다.

다. 확인검사

1) 생화학적 검사

브루셀라균의 분리용 배지는 Serum Dextrose 한천배지(배지 83)(또는 Liver 한천배지, 배지 26), Brucella 한천배지(배지 84)를 사용하며 5～10% 탄산가스 조건하에 37℃에서 3～5일간 배양한다. 이때 형성된 집락은 소원형으로서 다소 융기되어 있고 투명한 빛깔이 있으며 착색되어 있지 않으나 시일이 경과된 집락은 약간 불투명하고 갈색을 띤 회백색을 보인다. 염색하여 검경하면 그람음성의 단간균으로 구균처럼 보인다. 액체배지에서 37℃로 24시간 배양하면 균일 혼탁하게 발육하고 10일 이상 경과하면 더욱 혼탁하여지면서 적조한 균덩어리(clamp)가 균막과 같이 표면으로부터 관벽에 엉긴다. 이 균은 운동성이 없으며 당류도 거의 분해하지 않고 혈액배지에서 용혈성이 없다. MacConkey 한천배지(배지 30)에서 성장하지 않으며, urease 양성, oxidase 양성, catalase 양성 등 생화학적 시험 결과로 최종 판정한다.

2) PCR 시험방법

표 1의 primer set와 표2의 PCR 조건에 따라 PCR을 실시한다. Multiplex PCR의 경우 DNA 농도는 25 ng이상이며, 브루셀라 아보투스(B. abortus)와 종 확인 시 사용되는 BASS-PCR의 DNA농도는 1 ng이상이어야 한다. 두 PCR 기법에 사용되는 primer forward 및 reverse는 각각 10 pmol 씩 넣고, 상업적 시약인 20 μL용 PCR premix를 이용하여 PCR을 수행한다.

Target	Primer sequence			Size (bp)
Multiplex-PCR
BME1 0998f-0997r	Forward		5‘-ATC-CTA-TTG-CCC-CGA-TAA-GG-3'	1,682
	Reverse		5'-GCT-TCG-CAT-TTT-CAC-TGT-AGC-3'
BME2 0843f-0844r	Forward		5'-TTT-ACA-CAG-GCA-ATC-CAG-CA-3'	1,071
	Reverse		5'-GCG-TCC-AGT-TGT-TGT-TGA-TG-3'
BME2 0722f-0721r	Forward		5‘-CCA-ACC-GTA-TGT-CCT-CTC-3'	766
	Reverse		5'-TGC-GGG-AAC-TGG-TGT-TCG-AC-3'
BME2 0428f-0428r	Forward		5'-GCC-GCT-ATT-ATG-TGG-ACT-GG-3'	587
	Reverse		5'-AAT-GAC-TTC-ACG-GTC-GTT-CG-3'
BME1 0535f-0536r	Forward		5‘-GCG-CAT-TCT-TCG-GTT-ATG-AA-3'	450
	Reverse		5'-CGC-AGG-CGA-AAA-CAG-CTA-TAA-3'
BME1 r02f-r02r	Forward		5'-CTA-CTC-AAG-GAC-AAC-AGG-T-3'	344
	Reverse		5'-TGT-GTC-GTT-TAA-GGC-AAT-AG-3'
BR 0953f-0953r	Forward		5'-GGA-ACA-CTA-CGC-CAC-CTT-GT-3'	272
	Reverse		5'-GAT-GGA-GCA-AAC-GCT-GAA-G-3'
BME1 0752f-0752r	Forward		5'-CAG-GCA-AAC-CCT-CAG-AAG-C-3'	218
	Reverse		5'-GAT-GTG-GTA-ACG-CAC-ACC-AA-3'
BME2 0987f-0987r	Forward		5'-CGC-AGA-CAG-TGA-CCA-TCA-AA-3'	152
	Reverse		5'-GTA-TTC-AGC-CCC-CGT-TAC-CT-3'
BASS-PCR
IS711-specific		TGC-CGA-TCA-CTT-AAG-GGC-CTT-CAT-TGC-CAG
Abortus-specific		GAC-GAA-CGG-AAT-TTT-TCC-AAT-CCC
16S-universal-F		GTG-CCA-GCA-GCC-GCC-GTA-ATA-C
16S-universal-R		TGG-TGT-GAC-GGG-CGG-TGT-GTA-CAA-G
eri-F		GCG-CCG-CGA-AGA-ACT-TAT-CAA
eri-R		CGC-CAT-GTT-AGC-GGC-GGT-GA
RB51-3		GCC-AAC-CAA-CCC-AAA-TGC-TCA-CAA

표1. 브루셀라균 PCR용 primer set

	B. abortus	B. abortus S19	B. abortus RB51	Brucella spp.	Bacteria
Locus	Size (bp)
16S	800	800	800	800	800
IS711/alkB	500	500	500	-	-
IS711/wbo	-	-	300	-	-
eri	180		180	180	-

	Multiplex PCR		BASS-PCR
초기변성	95℃, 7분		95℃, 5분
변성	95℃, 35초	30회	95℃, 30초	40회
결합	61℃, 2분		61℃, 30초
신장	72℃, 1분		72℃, 1분
최종신장	72℃, 6분		72℃, 5분

표2. PCR 반응 조건

 

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.