1) 시험법 적용범위

축․수산물, 벌꿀 등에 적용한다. 다만, 갑각류의 경우 SEM 검출시에8.3.52니트로푸라존(Nitrofurazone) 시험법을 적용한다.

2) 분석원리

시료중의 푸라졸리돈, 푸랄타돈, 니트로푸라존 및 니트로푸란토인의 대사물질을 염산용액으로처리하여 니트로벤즈알데히드(NBA)로 유도체화한 후 에틸아세테이트로 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다. 다만, 니트로푸라존의 대사물질인 세미카바자이드(SEM)의 경우, 조직과 결합되어 있는 SEM을 정량한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준물질:3-amino-2-oxazolidinone(AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone(AMOZ), semicarbazide(SEM), 1-aminohydantoin(AHD)

라) 내부표준물질: 3-amino-2-oxazolidinone-d4(AOZ-d4), 3-amino-5-morpholinomethyl-2 -oxazolidinone-d5(AMOZ-d 5)

마) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

바) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

사)내부표준물질 원액: 100 mL 용량플라스크에 AOZ-d4, AMOZ-d5을 각각 정밀히 달아 메탄올에녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 내부 표준원액은 냉동 보관한다.

아) 내부표준물질 혼합용액: 100 mL 용량플라스크에 각 내부 표준원액을 메탄올로 희석하여 0.1mg/L가 되게 한다.

자) 0.125 M 염산(HCl): 1000 mL 용량플라스크에 5 M 염산 25 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

차) 0.05 M 유도체화용액: 100 mL 갈색용량플라스크에 2-니트로벤즈알데히드(2-NBA, MW 151.12, 99%) 0.76 g을 넣고 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 표시선까지 채운다. 이 용액은 사용직전에 만들어 사용한다.

카) 10 mM 유도체화용액: 100 mL 갈색용량플라스크에 2-니트로벤즈알데히드 0.152 g을 넣고 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 표시선까지 채운다. 이 용액은 사용 직전에 만들어 사용한다.

타) 1 M 인산칼륨 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 제이인산칼륨(K2HPO4) 175.6 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.

파) 0.1 M 인산칼륨 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 제이인산칼륨 17.56 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.

하) 1 M 수산화나트륨(NaOH) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 수산화나트륨 39.99 g을 넣고 물로 녹인 후 표시선까지 채운다.

거) 10 mM포름산암모늄 함유 0.1% 포름산 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

너) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 벌꿀

균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 ㉠{내부표준물질 혼합용액(0.1 mg/L) 100 μL를 넣고 15분간
정치하여 층을 분리시킨 후0.125 M 염산 5 mL와0.05 M 유도체화용액 200 μL를 넣고 37℃ 항온수조에서 흔들어 주면서 16시간 반응시킨다. 유도체화한 시험용액을 실온까지 냉각시킨 후 1 M 인산칼륨용액 5 mL와 1 M 수산화나트륨용액 100 μL를넣어pH를 약 7.0으로 맞춘다. 이 용액에 헥산 4 mL를넣고 흔들어 섞어 추출한후 4,800G에서 10분간 원심분리한다. 하층액을 새로운 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트4 mL를넣고혼합한 후, 4,800G에서 10분간 원심분리하고 상층액을 취하여 유리관에넣는다. 이런 과정을 2회 반복하여 얻어진 상층액을40℃ 이하에서질소농축하고 잔류물을50% 메탄올 0.5 mL에녹인 후, 7,500G에서 15분간 원심분리한다. 상층액을0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

나) 축·수산물

균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. ★[메탄올 8 mL과 물 1 mL를 넣고 30초간흔들어 섞은 후, 4℃에서 3,400G로 10분간 원심분리하고 상층액을 버린다. 다시 원심분리관에 메탄올 5 mL를 넣고 30초간흔들어 섞은 후4℃에서 3,400G로 10분간 원심분리하고 상층액을 버린다. 다시 원심분리관에 에탄올 5 mL를 넣고 30초간흔들어 섞은 후4℃에서 3,400G로 10분간 원심분리하고 상층액을 버린다.] 여기에 ㉡{내부표준물질 혼합용액 100 μL를넣고15분간정치하여 층을 분리시킨후0.125 M 염산 10 mL와 10 mM 유도체화용액 200 μL를 넣고 37℃ 항온수조에서 흔들어 주면서 16시간 반응시킨다. 유도체화한시험용액을 실온까지 냉각시킨 후 0.1 M 인산칼륨용액 10 mL(수산물의 경우 1 mL)와 1 M 수산화나트륨용액 1 mL를 넣어 pH를 약 7.4로 맞춘다. 이 시험용액의 잔류물을 제거하기위해 4℃에서 4,500G로 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 상층액을 새로운 50 mL원심분리관에 옮겨 헥산 10 mL를넣고혼합한 후 4℃에서 4,500G로 15분간 원심분리한다.하층액을 또 다른 새로운 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 7 mL를넣고혼합하고4℃에서 4,500G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 이런 과정을 2회 반복하여 얻어진상층액을40℃ 이하에서질소농축하고 잔류물을50% 메탄올 1 mL에녹여7,500G에서15분간 원심분리한다. 상층액을0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

※ ★과정(메탄올과 에탄올 세척)은 세미카바자이드(SEM) 검출시 확인 및 정량시험시에만적용한다.

6) 표준용액의 유도체화

음성시료(blank sample) 2 g을 50 mL 원심 분리관에 넣고 니트로푸란계 대사물질 혼합표준용액10, 20, 40, 50, 100 및 200 μg/L를 각각100 μL를 넣어5)의 ㉠(벌꿀의 경우), ㉡(축·수산물의 경우)의 시험용액의 조제 과정을 각각 따른 후 표준용액으로 사용한다.

7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 컬럼:C18(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 10 mM포름산암모늄 함유 0.1%포름산수용액

(나) 이동상 B: 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	90	10
0.5	90	10
7.0	10	90
10.0	10	90
10.1	90	10
13.0	90	10

(3) 유속: 0.4 mL/분

(4)컬럼온도: 35℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Capillary voltage: 3.8 kV

(4) Collision gas: Ar(아르곤)

(5)분석대상물질의 개별조건

연번	물질명 (Compound)	분석물질 (Analyzed compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	푸라졸리돈 (Furazolidone, AOZ)	2-NP-AOZ	4.4	Positive	235.1	236.1	78	20
							104	20
							134	10
2	푸랄타돈 (Furaltadone, AMOZ)	2-NP-AMOZ	3.6	Positive	334.1	335.1	128	20
							262	15
							291	10
3	니트로푸라존(Nitrofurazone, SEM)	2-NP-SEM	4.6	Positive	208.1	209.1	134	9
							166	9
							192	9
4	니트로푸란토인(Nitrofurantoine,AHD)	2-NP-AHD	4.4	Positive	248.1	249.1	104	20
							134	10
							178	15
5	푸라졸리돈-d4 (내부표준물질) (AOZ-d4,IS)	2-NP-AOZ-d4	4.4	Positive	239.1	240.1	134	15
6	푸랄타돈-d4 (내부표준물질) (AMOZ-d5,IS)	2-NP-AMOZ-d5	3.5	Positive	339.2	340.2	296	10

8) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고,표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

※ 갑각류의 경우 대사물질 SEM 확인으로 니트로푸라존 정성 시험이 가능하나, SEM 검출이 확인될 경우8.3.58니트로푸라존(Nitrofurazone) 시험법으로 확인․정량 시험한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

Furazolidone(2-NP-AOZ)