1) 시험법 적용범위
축수산물 등에 적용한다.
2) 분석원리
검체 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하여 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매：액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액：100 mL 용량플라스크에 각 표준품주1) 을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.
라) 혼합표준용액：100 mL 용량플라스크에 각 표준원액을 각 동물용의약품 잔류허용기준의 10배 농도가 되도록 취하여 혼합한 후 50% 메탄올로 표시선까지 채워 냉동실에 보관한다. 혼합표준용액은 50% 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.
마) 5 mM 초산암모늄을 함유한 물(pH 5.0)：500 mL 용량플라스크에 초산암모늄 0.193 g을 넣고 물 200 mL에 녹인 후 초산으로 pH 5.0이 되도록 조정하고 물로 표시선까지 채운다.
바) 기타시약：특급 또는 이와 동등한 것
 
주1. 니트로이미다졸계 및 대사산물

검사항목	분석대상물질
디메트리다졸(Dimetridazole)	디메트리다졸(Dimetridazole), HMMNI
로니다졸(Ronidazole)	로니다졸(Ronidazole), HMMNI
메트로니다졸(Metronidazole)	메트로니다졸(Metronidazole), 메트로니다졸-OH (Metronidazole-OH)
이프로니다졸(Ipronidazole)	이프로니다졸 (Ipronidazole), 이프로니다졸-OH (Ipronidazole-OH)

 
5) 시험용액의 조제
균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 20 mL을 넣어 균질화한 후 4℃에서 5,000 G로 5분간 원심분리 한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 20 mL을 넣고 10분간 진탕한 한 후 하층액을 취하고 40℃ 수욕상에서 질소농축한다. 잔류물에 50% 메탄올 1 mL을 가하여 녹인 후 0.2 μm 막 여과지(PVDF membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
(1) 칼럼：C18(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A : 5 mM 초산암모늄을 함유한 물(pH 5.0)
(나) 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	100	0
5	5	95
9	5	95
15	100	0
17	100	0

(3) 유속 : 0.2 mL/분
(4) 칼럼온도 : 40℃
(5) 주입량 : 10 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization : ESI(positive)
(2) Capillary temperature : 350℃
(3) Capillary voltage : 4.0 kV
(4) Collision gas : Ar(아르곤)
(5) 분석 대상 및 개별조건(MRM 조건)

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간(분)	분자량	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)1	충돌에너지 (Collision Energy,eV)
1	디메트리다졸 (Dimetridazole)	4.0	141.1	142.0	54.9	18
					81.1	18
					96.1	10
					112.1	10
2	HMMNI	3.6	158.1	158.0	55.0	14
					67.0	22
					94.1	18
					112.0	16
3	로니다졸 (Ronidazole)	3.7	200.2	201.1	55.1	18
					67.0	26
					110.1	14
					140.1	8
4	메트로니다졸 (Metronidazole)	3.6	171.2	172.1	45.1	14
					56.2	18
					82.1	18
					111.1	18
5	메트로니다졸-OH (Metronidazole-OH)	3.3	188.2	188.0	68.1	18
					80.0	28
					123.1	8
					126.1	14
6	이프로니다졸 (Ipronidazole)	4.9	169.2	170.0	81.2	26
					96.1	16
					109.1	20
					123.2	30
7	이프로니다졸-OH (Ipronidazole-OH)	4.3	186.2	186.1	107.0	22
					122.0	16
					128.0	14
					168.1	20

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험
가) 정성
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율이 20～30 % 이내에서 일치하여야 한다. ※ 주2) 참조
 
주2. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤ 20 %
> 20 %∼≤ 50 %	≤ 25 %
> 10 %∼≤ 20 %	≤ 30 %

 
나) 표준품 크로마토그램
 

디메트리다졸 (4.0분, 0.001 mg/L)

HMMNI (3.6분, 0.004 mg/L)

로니다졸 (3.7분, 0.001 mg/L)

메트로니다졸 (3.6분, 0.001 mg/L)

메트로니다졸-OH (3.3분, 0.001 mg/L)

이프로니다졸 (4.9분, 0.001 mg/L)

이프로니다졸-OH (4.2분, 0.001 mg/L)

 
그림 1. 디메트리다졸, HMMNI, 로니다졸, 메트로니다졸, 메트로니다졸-OH, 이프로니다졸, 이프로니다졸-OH 표준품의 크로마토그램
8) 정량시험
가) 정량
정성시험과 똑같은 조건에서 음성검체에(Blank sample)에 혼합표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.
9) 정량한계
디메트리다졸 : 0.0005 mg/kg
로니다졸 : 0.0005 mg/kg
메트로니다졸 : 0.0005 mg/kg
이프로니다졸 : 0.0005 mg/kg
HMMNI : 0.002 mg/kg
메트로니다졸-OH : 0.0005 mg/kg
이프로니다졸-OH : 0.0005 mg/kg