8.3.20시미아졸(Cymiazole), 아미트라즈(Amitraz ), 코마포스( Coumaphos ), 플루발리네이트( Fluvalinate )

1) 시험법 적용범위
벌꿀 등에 적용한다.

2) 분석원리
시료중 분석 대상물질을 물과 아세토니트릴로 추출한 후 원심분리하여 상층액을 취해 PSA(Primary Secondary Amine), C 18및 황산나트륨을 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 0.1%포름산 수용액: 1 L 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 0.2 M 인산수소이나트륨(Na2HPO4)수용액: 1 L 용량플라스크에 인산수소이나트륨 28.4 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제
균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 0.2 M 인산수소이나트륨 수용액 5 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞는다.아세토니트릴 12 mL과 MgSO46 g, NaCl 1.5 g을넣고10분간흔들어 섞은 뒤4℃, 2,600G에서 15분간 원심분리한다. PSA 150 mg, C18150 mg, MgSO4900 mg이 담긴 50 mL 원심분리관에 상층액 15 mL를 넣e고 10분간흔들어 섞고4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 전량 취하여45℃ 이하에서 질소 농축한 후 아세토니트릴 1 mL를넣고5분간흔들어 섞은 후4℃, 15,000G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을0.2 μm PTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 후 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산 수용액

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	20	80
10	20	80

(3) 유속: 0.2 mL/분

(4) 컬럼온도: 30℃

(5) 주입량: 2 μL

나) 질량분석기 분석조건

(1) Ionization mode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Capillary voltage: 3.8 kV

(4) Collision gas:N2(질소)

(5) 분석대상물질의 개별조건

연   번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	시미아졸 (Cymiazole)	1.31	Positive	218.1	219	144	39
						171	33
						105	37
2	아미트라즈 (Amitraz)	4.32	Positive	293.2	294	163	17
						122	37
						107	55
3	2,4-디메틸아닐린* (2,4-Dimethylaniline)	1.73	Positive	121.1	122	107	21
						77	35
4	코마포스 (Coumaphos)	2.77	Positive	362.0	363	105	21
						227	27
						307	21
5	플루발리네이트 (Fluvalinate)	6.99	Positive	502.1	503	211	35
						208	19
						181	37

* 2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline): 아미트라즈(Amitraz)의 대사산물임

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고,표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

시미아졸

아미트라즈

2,4-디메틸아닐린