8.3.21트리클라벤다졸(Triclabendazole)
1) 시험법 적용범위
수산물 등에 적용한다.
2) 분석원리
시료중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출한 후 분산고체상 추출법(dispersive solid phase extraction)으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액: 각 표준품(주1)참조)을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.
라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록메탄올로 희석하여 사용한다.
마) 내부표준물질 표준원액: 옥시벤다졸-D7표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 DMSO로표시선까지 채워 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 내부표준물질 표준원액은 냉동 보관한다.
바) 내부표준물질 용액: 내부표준물질 표준원액을 메탄올로 희석하여 1 mg/L가 되게 한다.
사) 맥바인(Macllvaine) 완충용액(pH 2): 0.1 M 구연산(citric acid, anhydrous) 수용액 500 mL에 0.2 M 인산나트륨(disodium hydrogen phosphate) 용액 45 mL를 넣어pH를 2로 맞춘다.
아) 산화방지용액: 250 mL 용량플라스크에 EDTA․4Na(tetra sodium-ethylene diamine tetraacetate)0.07 g, 아스코르빈산 9 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
자) 20 mM포름산암모늄 용액: 1 L 용량플라스크에포름산암모늄(ammonium formate) 1.26 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.
차) 0.1%포름산수용액: 100 mL 용량플라스크에포름산(formic acid) 0.1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.
카) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
주1)트리클라벤다졸의 대사산물
검사항목 |
분석대상물질 |
트리클라벤다졸 (Triclabendazole) |
트리클라벤다졸(Triclabendazole), 케토트리클라벤다졸(Keto-triclabendazole) |
5) 시험용액의 조제
가)연어 및 장어 이외 어류
균질화한시료4 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 산화방지용액 1 mL와 황산암모늄 2 g을넣고10분간흔들어 섞은 뒤, 내부표준물질 용액 400 μL를넣고60분간 평형화(equilbration)시킨다.염화나트륨 0.3 g과 맥바인 완충용액 2 mL를넣고5분간흔들어 섞는다. ⓐ아세토니트릴 5 mL를 넣어 15분간 강하게흔들어 섞고 4℃에서 5,600G로 20분간 원심분리한 후 상층액을 취하여산화방지용액 50 μL를넣는다.ⓑ잔류물에 아세토니트릴 5 mL를넣고15분간 강하게흔들어섞고 4℃에서 5,600G로 20분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 산화방지용액 50 μL를넣는다.ⓐ와 ⓑ의상층액을 합한 후MgSO4900 mg과 일차이차아민(Primary Secondary Amine, PSA)150 mg이담긴 15 mL 원심분리관에 옮겨 10분간흔들어 섞어 추출한 후 상온에서 5,600G로15분간 원심분리한다. 상층액을 10 mL 둥근바닥플라스크에 옮겨감압(또는 질소)농축한 후 메탄올500 μL를 넣어 녹인다. 마이크로 원심분리관에 옮겨 상온에서 3,500G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.
나)연어, 장어균질화한시료4 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 산화방지용액 1 mL와 황산암모늄 2 g을넣고10분간흔들어 섞는다.내부표준물질 용액 400 μL를넣은 후60분간 평형화(equilibration) 시킨다. 유는 염화나트륨 1 g과 황산마그네슘 4 g을넣고,그 외는 염화나트륨 0.3 g을넣어5분간흔들어 섞는다.ⓐ0.1% 암모니아 함유 아세토니트릴 5 mL를 넣고 15분간 강하게흔들어 섞은 후4℃에서 5,600G로20분간 원심분리 후 상층액을 취하여 산화방지용액 50 μL를넣는다. ⓑ잔류물에 0.1% 암모니아 함유 아세토니트릴 5 mL를 넣고 15분간 강하게흔들어 섞은 후4℃에서 5,600G로 20분간 원심분리 후 상층액을 취하여 산화방지용액 50 μL를넣는다. ⓐ와 ⓑ의 상층액을 합한 후 모아진상층액을MgSO4900 mg, 일차이차아민(Primary Secondary Amine, PSA) 150 mg과 C18150 mg이담긴 15 mL 원심분리관에 옮겨 10분간흔들어 섞어 추출한 후상온에서 5,600G로 15분간 원심분리한다. 상층액을 둥근바닥플라스크에 옮겨감압(또는 질소) 농축한 후 메탄올 500 μL를 넣고녹인 후, 마이크로 원심분리관에 옮겨 상온에서 3,500G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1)컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
(2) 이동상
(가) 이동상 A: 20 mM포름산암모늄 수용액
(나) 이동상 B: 0.1%포름산 함유아세토니트릴
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0.0 |
83 |
17 |
0.1 |
83 |
17 |
7.0 |
55 |
45 |
12.0 |
55 |
45 |
14.0 |
5 |
95 |
18.5 |
5 |
95 |
21.0 |
83 |
17 |
23.0 |
83 |
17 |
(3) 유속: 0.2 mL/분
(4)컬럼온도: 40℃
(5) 주입량: 5 μL
나) 질량분석기 조건
(1) Ionization mode: ESI(positive, negative)
(2) Capillary temperature: 350℃
(3) Collision gas: N2(질소)
연번 |
물질명 (Compound) |
머무름 시간 (분) |
이온화 (Ionization mode) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온 (Precursor ion,m/z) |
생성이온 (Product ion,m/z) |
충돌에너지 (Collision energy, eV) |
1 |
트리클라벤다졸 (Triclabendazole) |
17.72 |
Positive |
358.0 |
361 |
346 |
30 |
274 |
44 |
||||||
199 |
50 |
||||||
2 |
케토트리클라벤다졸 (Keto-triclabendazole) |
16.57 |
Negative |
328.0 |
327 |
181 |
24 |
146 |
35 |
||||||
118 |
45 |
||||||
3 |
옥시벤다졸-d7(내부표준물질) (Oxibendazole-d7,IS) |
11.00 |
Positive |
256.2 |
257 |
225 |
16 |
177 |
30 |
||||||
149 |
42 |
※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
7) 정성시험
가) 정성 및 확인
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주2)와 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 첨넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.
주2)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %) |
허용범위 |
> 50% |
± 20% |
> 20%, ≤ 50% |
± 25% |
> 10%, ≤ 20% |
± 30% |
트리클라벤다졸 |
|