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▶ 제 8. 일반시험법 ▶ 8. 식품 중 잔류동물용의약품시험법 ▶ 8.3 정량시험법 ▶ 8.3.24 락토파민(Ractopamine), 살부타몰(Salbutamol), 시마테롤(Cimaterol), 질파테롤(Zilpaterol),클렌부테롤(Clenbuterol)
  • 8.3.24락토파민(Ractopamine), 살부타몰(Salbutamol), 시마테롤(Cimaterol), 질파테롤(Zilpaterol),클렌부테롤(Clenbuterol)

    1) 시험법 적용범위

    축·수산물 등에 적용한다.

    2) 분석원리

    시료를 과염소산으로 가수분해하여pH를 12로 맞춘다음 에틸아세테이트로 액-액 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

    3) 장치

    액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

    4) 시약 및 시액

    가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

    나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

    다) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

    라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록메탄올로 희석하여 사용한다. 조제된 표준용액은냉동 보관한다.

    마) 내부표준물질 표준원액: 질파테롤-d7, 락토파민-d3및 클렌부테롤-d9표준품을 각각 정밀히달아 메탄올에 녹여 100mg/L로 하여 냉동 보관한다.

    바) 내부표준물질 혼합용액: 내부 표준물질 표준원액을 메탄올로 희석하고 냉동보관하여 사용한다. 100 mL 용량플라스크에 각 내부 표준원액을 메탄올로 희석하여 0.01 mg/L가 되게 한다.

    사) 0.4 N 과염소산: 70∼73% 과염소산 5.74 g을 100 mL 용량플라스크에 취하여 물로 녹여 표시선까지 채운다.

    아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

    5) 첨가시료의 조제

    조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.

    6) 시험용액의 조제

    균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 내부표준물질 혼합용액(0.01 mg/L) 500 μL
    를넣고15분간 정치한 후, 0.4 N 과염소산 20 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다 . 4℃, 4,800G에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 상층액을 5 M 수산화나트륨용액을 사용하여pH를 12로 맞춘 다음, ⓐ에틸아세테이트 10 mL를넣고10분간흔들어 섞은후 4℃, 4,800G에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한다. ⓐ과정을 추가로 2회 반복한 뒤, 40℃에서 질소농축하고 잔류물을 0.01 N 염산 1 mL에 녹인 후0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

    7) 시험조작

    가) 액체크로마토그래프 측정조건

    (1)컬럼:C18(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

    (2)이동상

    (가) 이동상 A: 0.1% 포름산 수용액

    (나) 이동상 B: 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴

    시간(분)

    이동상 A(%)

    이동상 B(%)

    0

    98

    2

    1

    98

    2

    8

    5

    95

    11

    5

    95

    12

    98

    2

    15

    98

    2

    (3) 유속: 0.3 mL/분

    (4) 컬럼 온도: 40℃

    (5) 주입량: 10 μL

    나) 질량분석기 측정조건

    (1) Ionization mode: ESI (positive)

    (2) Capillary temperature: 350℃

    (3) Capillary voltage: 4.8 kV

    (4) Collision gas: Ar(아르곤)

    분석성분

    (Compound)

    머무름 시간

    (분)

    이온화

    (Ionization

    mode)

    관측질량

    (Exact mass)

    선구이온

    (Precursor ion,m/z)

    생성이온(Product

    ion,m/z)

    충돌에너지

    (Collision

    energy, eV)

    1

    락토파민

    (Ractopamimine)

    4.95

    [M+H]+

    301.2

    302.2

    164.1

    16

    284.1

    12

    107.0

    33

    2

    살부타몰

    (Salbutamol)

    4.19

    [M+H]+

    239.2

    240.2

    148.1

    18

    222.2

    10

    166.2

    13

    3

    시마테롤

    (Cimaterol)

    4.25

    [M+H]+

    219.1

    220.0

    202.1

    10

    160.1

    16

    143.1

    21

    4

    질파테롤

    (Zilpaterol)

    4.14

    [M+H]+

    261.2

    262.2

    244.1

    12

    185.1

    23

    202.1

    18

    5

    클렌부테롤

    (Clenbuterol)

    5.31

    [M+H]+

    276.1

    227.1

    203.0

    16

    259.0

    11

    132.0

    27

    6

    락토파민-d3(내부표준물질)

    (Ractopamimine-d3,IS)

    4.96

    [M+H]+

    304.2

    305.2

    167.1

    16

    7

    질파테롤-d7(내부표준물질)

    (Zilpaterol-d7, IS)

    4.14

    [M+H]+

    268.2

    269.2

    251.1

    14

    8

    클렌부테롤-d9(내부표준물질)

    (Clenbuterol-d9, IS)

    5.31

    [M+H]+

    285.2

    286.1

    204.0

    17

    (5) 분석대상물질의 개별조건

    ※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

    8) 정성시험

    가) 정성

    위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
    확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

    주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

    이온간 반응세기의 비율 (%)

    허용범위

    > 50%

    ≤ 20%

    > 20% ≤ 50%

    ≤ 25%

    > 10%, ≤ 20%

    ≤ 30%

    나) 표준품 크로마토그램

    락토파민 (Ractopamine)

    살부타몰 (Salbutamol)

    시마테롤 (Cimaterol)

    질파테롤 (Zilpaterol)