8.3.24락토파민(Ractopamine), 살부타몰(Salbutamol), 시마테롤(Cimaterol), 질파테롤(Zilpaterol),클렌부테롤(Clenbuterol)
1) 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.
2) 분석원리
시료를 과염소산으로 가수분해하여pH를 12로 맞춘다음 에틸아세테이트로 액-액 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.
3) 장치
액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)
4) 시약 및 시액
가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.
라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록메탄올로 희석하여 사용한다. 조제된 표준용액은냉동 보관한다.
마) 내부표준물질 표준원액: 질파테롤-d7, 락토파민-d3및 클렌부테롤-d9표준품을 각각 정밀히달아 메탄올에 녹여 100mg/L로 하여 냉동 보관한다.
바) 내부표준물질 혼합용액: 내부 표준물질 표준원액을 메탄올로 희석하고 냉동보관하여 사용한다. 100 mL 용량플라스크에 각 내부 표준원액을 메탄올로 희석하여 0.01 mg/L가 되게 한다.
사) 0.4 N 과염소산: 70∼73% 과염소산 5.74 g을 100 mL 용량플라스크에 취하여 물로 녹여 표시선까지 채운다.
아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것
5) 첨가시료의 조제
조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.
6) 시험용액의 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 내부표준물질 혼합용액(0.01 mg/L) 500 μL
를넣고15분간 정치한 후, 0.4 N 과염소산 20 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다 . 4℃, 4,800G에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 상층액을 5 M 수산화나트륨용액을 사용하여pH를 12로 맞춘 다음, ⓐ에틸아세테이트 10 mL를넣고10분간흔들어 섞은후 4℃, 4,800G에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한다. ⓐ과정을 추가로 2회 반복한 뒤, 40℃에서 질소농축하고 잔류물을 0.01 N 염산 1 mL에 녹인 후0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
7) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 측정조건
(1)컬럼:C18(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것
(2)이동상
(가) 이동상 A: 0.1% 포름산 수용액
(나) 이동상 B: 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴
시간(분) |
이동상 A(%) |
이동상 B(%) |
0 |
98 |
2 |
1 |
98 |
2 |
8 |
5 |
95 |
11 |
5 |
95 |
12 |
98 |
2 |
15 |
98 |
2 |
(3) 유속: 0.3 mL/분
(4) 컬럼 온도: 40℃
(5) 주입량: 10 μL
나) 질량분석기 측정조건
(1) Ionization mode: ESI (positive)
(2) Capillary temperature: 350℃
(3) Capillary voltage: 4.8 kV
(4) Collision gas: Ar(아르곤)
연 번 |
분석성분 (Compound) |
머무름 시간 (분) |
이온화 (Ionization mode) |
관측질량 (Exact mass) |
선구이온 (Precursor ion,m/z) |
생성이온(Product ion,m/z) |
충돌에너지 (Collision energy, eV) |
1 |
락토파민 (Ractopamimine) |
4.95 |
[M+H]+ |
301.2 |
302.2 |
164.1 |
16 |
284.1 |
12 |
||||||
107.0 |
33 |
||||||
2 |
살부타몰 (Salbutamol) |
4.19 |
[M+H]+ |
239.2 |
240.2 |
148.1 |
18 |
222.2 |
10 |
||||||
166.2 |
13 |
||||||
3 |
시마테롤 (Cimaterol) |
4.25 |
[M+H]+ |
219.1 |
220.0 |
202.1 |
10 |
160.1 |
16 |
||||||
143.1 |
21 |
||||||
4 |
질파테롤 (Zilpaterol) |
4.14 |
[M+H]+ |
261.2 |
262.2 |
244.1 |
12 |
185.1 |
23 |
||||||
202.1 |
18 |
||||||
5 |
클렌부테롤 (Clenbuterol) |
5.31 |
[M+H]+ |
276.1 |
227.1 |
203.0 |
16 |
259.0 |
11 |
||||||
132.0 |
27 |
||||||
6 |
락토파민-d3(내부표준물질) (Ractopamimine-d3,IS) |
4.96 |
[M+H]+ |
304.2 |
305.2 |
167.1 |
16 |
7 |
질파테롤-d7(내부표준물질) (Zilpaterol-d7, IS) |
4.14 |
[M+H]+ |
268.2 |
269.2 |
251.1 |
14 |
8 |
클렌부테롤-d9(내부표준물질) (Clenbuterol-d9, IS) |
5.31 |
[M+H]+ |
285.2 |
286.1 |
204.0 |
17 |
※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임
8) 정성시험
가) 정성
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.
주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위
이온간 반응세기의 비율 (%) |
허용범위 |
> 50% |
≤ 20% |
> 20% ≤ 50% |
≤ 25% |
> 10%, ≤ 20% |
≤ 30% |
나) 표준품 크로마토그램
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락토파민 (Ractopamine) |
살부타몰 (Salbutamol) |
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시마테롤 (Cimaterol) |
질파테롤 (Zilpaterol) |
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