분지글리코실트랜스퍼라아제

Branching Glycosyltransferase

1,4-α-Glucan Branching Enzyme

분지글리코실전달효소

 

정    의  이 품목은 Rhodothermus obamensis의 분지글리코실트랜스퍼라아제 유전자가 삽입된 Bacillus subtilis의 배양물에서 얻어진 효소제이다. 다만, 역가조정, 품질보존 등을 위하여 희석제, 안정제 등을 첨가할 수 있다.

  이 품목은 아밀로오스 등의 α-1,4-글루코시드 결합을 비환원성 말단에서 α-1,6-글루코시드 결합으로 변형시킨다.

성    상  이 품목은 백∼진한 갈색의 분말, 입상, 페이스트상 또는 무∼진한 갈색의 액상이다.

확인시험  이 품목의 활성시험법에 따라 시험할 때 활성을 나타내어야 한다.

순도시험  (1)비소 : 이 품목을 비소시험법에 따라 시험할 때, 그 양은 4.0ppm 이하이어야 한다.

  (2) 납 : 이 품목 5.0g을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 시험할 때, 그 양은 5.0ppm 이하이어야 한다.

  (3) 대장균군 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 대장균군에 따라 시험할 때, 제품 1g당 30 이하이어야 한다.

  (4) 살모넬라 : 이 품목은 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 살모넬라에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

  (5) 대장균 : 이 품목 25g을 취하여 「식품의 기준 및 규격」일반시험법의 미생물시험법 중 대장균에 따라 시험할 때, 음성(-)이어야 한다.

활성시험법(역가)

  분석원리 : 본 역가시험은 기질인 아밀로오스에서 1-6-α 결합이 생성되는 속도를 측정해 계산하며, 효소 활성은 Branching Enzyme Units(BEU)으로 표시한다. 1 BEU는 주어진 표준조건에서(pH 7.2, 60℃) 시험조작 후 660nm에서 아밀로오스-요오드 complex의 흡광도를 측정하는데 근거를 두고 있다.

  시험용액의 조제 : 약 1g(± 0.5mg)의 효소를 비이커에 취하여 Tris-HCl 완충액 80mL를 가하고 30분간 천천히 교반하여 효소를 완전히 용해시킨 후 100mL 용량플라스크에 넣고 Tris-HCl완충액을 가하여 전량을 100mL로 맞춘다. 필요시 이를 다시 Tris-HCl 완충액으로 희석하여, 희석된 시험용액의 효소 활성을 30∼50 BEU/mL이내로 맞춘다. 희석배수(D)를 계산하여 활성계산에 이용한다(보통 희석배수는 10∼40 범위임). 시험 당일 조제하여 사용한다.

  시험조작 : 시험관에 각각 다음과 같이 내용물을 넣는다.(각각 4번 반복용으로 준비) 시험용액은 50μL의 시험용액(Vs=0.050mL)과 50μL의 기질용액을 넣어 혼합하고, 대조액은 50μL의 물과 50μL의 기질용액을 넣어 혼합하며, 공시험액은 100μL의 물을 넣는다. 각각을 잘 혼합한 후 모든 시험관을 60℃에서 반응시간으로 30분(t)간 반응시키고, 30분 후 각각에 2mL씩의 stop reagent를 가하고 혼합한 후 실온에서 20분간 정치시켜 발색을 안정화시켜 660nm에서 흡광도를 측정한다. 각각 4번 반복 실험하여 평균 흡광도를 구한다(효소시험용액의 평균 흡광도:A_S, 대조군의 평균흡광도:A_R, 공시험액의 평균흡광도:A_B)

    ※ 효소시험용액의 흡광도는 0.15∼0.3이어야 한다. 그렇지 않은 경우에는 0.1M Tris-HCl(pH 7.2) 완충액을 이용하여 시험용액의 희석정도를 조정하여 다시 측정한다.

  다음의 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.

 

역가(BEU/g) =	(AR–AS)×V×D×100
	(AR–AB)×t×Vs×W

 

(AR-AS): 대조군과 효소시험용액의 흡광도 차이 (AR-AB): 대조군과 공시험액의 흡광도 차이 V: 효소시험용액의 최초용량(mL) D: 희석배수 100: 효소활성단위를 BEU/g으로 표시하기 위한 환산계수 t: 반응시간(분) VS: 시험조작에 사용된 효소시험용액이 용량(mL) W: 검체의 양(g)

 

  역가의 정의 : Branching Enzyme Units(BEU)는 상기 시험의 주어진 조건에서(pH 7.2, 60℃) 시험 조작 후 660nm에서 아밀로오스-요오드 complex의 흡광도를 측정 시, 분당 1%의 감소를 가져오는 효소의 양으로 정의한다.