2-51 니트로사민류 및 니트로사민류 생성 가능물질 시험법
 
가. 분석원리
고무제에서 용출되는 니트로사민류 및 니트로사민류 생성 가능물질을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 측정한다.
 
나. 장치
액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기
 
다. 시약 및 시액
1) 인공타액
탄산수소나트륨 4.2 g, 염화나트륨 0.5 g, 탄산칼륨 0.2 g, 아질산나트륨 30 mg에 물 900 mL를 가하여 녹인 후 0.1 N 염산용액 또는 0.1 N 수산화나트륨용액을 사용하여 pH를 9.0으로 조정한 액에 물을 가하여 1 L로 한 액을 인공타액으로 한다.
 
라. 표준용액
1) 표준원액
N-니트로소디메틸아민(N-nitrosodimethylamine), N-니트로소디에틸아민(N-nitrosodiethyl amine), N-니트로소디-n-프로필아민(N-nitrosodi-n-propylamine), N-니트로소디-n-부틸아민(N-nitrosodi-n-buthylamine), N-니트로소피페리딘(N-nitrosopiperidine), N-니트로소피롤리딘(N-nitrosopyrrolidine) 및 N-니트로소몰폴린(N-nitrosomorpholine) 20 mg을 정밀히 달아 각각 메탄올에 녹여 100 mL로 한 액을 각각의 표준원액으로 한다.
2) 혼합표준용액
각 표준원액 5 mL씩을 취하여 100 mL 메스플라스크에 넣은 다음 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다. 이 액 5 mL를 취하여 100 mL 메스플라스크에 넣고 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한 액과 내부표준용액을 1:1(v/v)로 혼합한 액을 혼합표준용액으로 한다(니트로사민류 각각 0.25 μg/mL). 차광하여 5℃ 이하에서 보관한다.
3) 내부표준용액
N-니트로소디-n-프로필아민-d ₁₄(N-nitrodi-n-propylamine-d ₁₄) 또는 N-니트로소디이소프로필아민(N-nitrosodiisopropylamine) 20 mg을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mL로 한다. 이 액 1 mL를 취하여 200 mL 메스플라스크에 넣고 아세토니트릴을 가하여 200 mL로 한 액을 내부표준용액으로 한다(1 μg/mL). 차광하여 5℃ 이하에서 보관한다.
 
마. 시험조작
1) 액체크로마토그래프/질량분석기/ 질량분석기 측정조건
- 칼럼 : C ₁₈(3 mm I.D. × 250 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
- 칼럼온도 : 40℃
- 검출기 : 질량분석기
․Ionization : ESI(positive)
․Capillary Temperature : 330℃
․Collision gas : Ar
․Collision Voltage : 10 ～ 40 V
․특이이온

	Precursor ion(m/z)	Fragment ion(m/z)
N-니트로소디메틸아민	75.0	43.2
N-니트로소디에틸아민	103.0	43.3, 75.3
N-니트로소디-n-프로필아민	131.0	43.2, 89.2
N-니트로소디-n-부틸아민	159.1	57.2, 103.2
N-니트로소피페리딘	115.0	41.2, 69.0
N-니트로소피롤리딘	101.1	55.2
N-니트로소몰폴린	117.1	86.2
N-니트로소디-n-프로필아민-d14	145.0	50.8, 97.0
N-니트로소디이소프로필아민	131.0	43.2, 89.2

필요에 따라 적절히 조절한다.
- 이동상 : A : 0.1% 개미산 수용액, B : 아세토니트릴
- 농도기울기 : A : B(80 : 20)에서 A : B(0 : 100)까지의 직선 농도기울기를 10분간 실시하고, A : B(0 : 100)으로 5분간 유지한다. 필요에 따라 적절히 조절한다.
- 유속 : 분당 0.2 mL
2) 니트로사민류
가) 시험용액의 조제
시료가 잠길 정도의 끓는 물에 시료를 넣고 10분간 끓이고 식힌 후 세로로 둘로 잘라 건조시킨다. 건조시킨 시료 10 g ± 0.2 g을 정밀히 달아 플라스크에 넣고 40℃로 가온한 인공타액 40 mL를 가하여 잠기도록 한 후 마개로 막고 40℃를 유지하면서 24시간 방치한다. 이 액을 50 mL 메스플라스크에 옮기고 시료를 인공타액 5 mL로 씻어준 후 그 씻은 액을 합하고 물을 가하여 50 mL로 한 액을 A액으로 한다. A액 40 mL를 정확히 취하여 분액여두에 옮겨 주고 이에 내부표준용액 0.5 mL 및 0.1 N 수산화나트륨용액 1 mL를 각각 가해준 다음 디클로로메탄 20 mL를 가하여 5분간 격렬하게 진탕한 후 정치하여 디클로로메탄 층을 쿠데르나다니쉬농축기 수기에 옮긴다. 남은 여액에 디클로로메탄 20 mL를 가하고 위와 동일하게 조작하여 디클로로메탄 층을 앞의 쿠데르나다니쉬농축기 수기에 합한 다음 아세토니트릴 1 mL를 가하여 혼합한 후 상온에서 질소를 서서히 흘려주며 1 mL로 농축한 액을 시험용액으로 한다.
나) 정성시험
시험용액 및 혼합표준용액을 각각 5 μL 씩 사용하여 1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 측정조건에 따라 액체크로마토그래피/질량분석을 행하고, 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 혼합표준용액 크로마토그램의 각 니트로사민의 피크검출시간이 일치하는지 확인한다.
다) 정량시험
나) 정성시험에서 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 혼합표준용액 크로마토그램의 각 니트로사민 피크검출시간이 일치할 때에는 다음의 시험을 한다.
나) 정성시험에서 얻어진 시험결과를 토대로 시험용액 및 표준용액 크로마토그램의 내부표준물질 피크면적에 대한 니트로사민류 각각의 피크면적 비를 구하여 다음 식에 따라 검출된 각 니트로사민의 양을 시료 무게 당으로 산출(M _A)하고, 얻어진 결과를 모두 합하여 최종 니트로사민의 양을 구한다.

니트로사민 (MA, mg/kg)	=	5	× c ×	Rt	×	1
		4		Rs		시료의 채취량(g)

c : 혼합표준용액 중 해당 니트로사민의 농도(μg/mL)
Rt : 시험용액 크로마토그램의 내부표준물질 피크면적에 대한 해당 니트로사민 피크면적의 비
Rs : 표준용액 크로마토그램의 내부표준물질 피크면적에 대한 해당 니트로사민 피크면적의 비
 
3) 니트로사민류 생성 가능물질
가) 시험용액의 조제
2) 가)의 A액 10 mL에 0.1 N 염산용액 1 mL를 가한 후 밀전하여 암소에서 30분간 방치한 액을 분액여두에 옮겨 주고 이에 내부표준용액 0.5 mL 및 0.1 N 수산화나트륨용액 2 mL를 각각 가해준 다음 디클로로메탄 20 mL를 가하여 5분간 격렬하게 진탕한 후 정치하여 디클로로메탄 층을 쿠데르나다니쉬농축기 수기에 옮긴다. 남은 여액에 디클로로메탄 20 mL를 가하고 위와 동일하게 조작하여 디클로로메탄 층을 앞의 쿠데르나다니쉬농축기 수기에 합한 다음 아세토니트릴 1 mL를 가하여 혼합한 후 상온에서 질소를 서서히 흘려주며 1 mL로 농축한 액을 시험용액으로 한다.
나) 정성시험
시험용액 및 혼합표준용액을 각각 5 μL 씩 사용하여 1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 측정조건에 따라 액체크로마토그래피/질량분석을 행하고, 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 혼합표준용액 크로마토그램의 각 니트로사민의 피크검출시간이 일치하는지 확인한다.
다) 정량시험
나) 정성시험에서 시험용액 크로마토그램의 피크검출시간과 혼합표준용액 크로마토그램의 각 니트로사민의 피크검출시간이 일치할 때에는 다음의 시험을 한다.
나) 정성시험에서 얻어진 시험결과를 토대로 시험용액 및 표준용액 크로마토그램의 내부표준물질 피크면적에 대한 니트로사민류 각각의 피크면적의 비를 구하여 다음 식에 따라 검출된 각 니트로사민의 양을 시료 무게 당으로 산출(M _B) 한다. 검출된 각 니트로사민에 대하여 M _B - M _A 값을 구하고, 얻어진 결과를 모두 합하여 최종 니트로사민류 생성 가능물질의 양을 구한다.

니트로사민 (MB, mg/kg)	=	5	× c ×	Rt	×	1
				Rs		시료의 채취량(g)

c : 혼합표준용액 중 해당 니트로사민의 농도(μg/mL)
Rt : 시험용액 크로마토그램의 내부표준물질 피크면적에 대한 해당 니트로사민 피크면적의 비
Rs : 표준용액 크로마토그램의 내부표준물질 피크면적에 대한 해당 니트로사민 피크면적의 비